免疫层析试纸检测技术研究进展

王寅彪，刘 肖，李青梅，郭军庆

·综述·

免疫层析试纸检测技术研究进展

王寅彪1，2，刘 肖2，李青梅2，郭军庆2

目的 探讨免疫层析试纸检测在即时检测中的研究现状及未来的发展方向和应用价值。方法 参阅国内外发表的文献，综述免疫层析试纸在抗原、抗体、半抗原检测领域的应用及利用新纳米材料提高检测敏感度的设计策略。结果 传统的免疫层析试纸主要以胶体金作为示踪物利用竞争法或夹心法对半抗原、抗原和抗体等进行检测，但存在敏感度不足及定量检测受限等问题，结合不同纳米材料进行新型试纸研发将有助于克服这些缺陷，向更高敏感性、定量、多联的检测方向发展。结论 免疫层析试纸是进行即时检测和现场检测的重要工具，未来可用于对大规模群体实施检测，获取大数据，建立疾病或食品安全预警评价信息平台。

免疫色谱法；免疫层析试纸；综述

Abstract：Objective This paper aimed to review the current use and future development of immunochromatographic strip in instant testing. Methods Advanced research papers were studied and reviewed for summarizing the use of strip test in detecting antigens，antibodies，and haptens，and novel strategies in enhancing sensitivity of the strip test utilizing new nano-materials. Results Conventional strip test mainly used colloidal gold as tracers or competition format for detecting antigens，antibodies，and haptens.However， it was limited by relatively low sensitivity and difficulty of quantitate detection.Combination of different newly-developed nano-materials with strip will be helpful for more sensitive，quantitative，and multiplex detection. Conclusion Immunochromatographic strip is an important application for instant testing and site detection，and will be used for detecting large population for acquiring big data and establishing prewarning platforms of disease prevention and food safety surveillance.

Key words：immunochromatography；immunochromatographic test strip；review

免疫层析试纸检测技术是基于单克隆抗体技术、免疫标记技术及免疫层析技术发展起来的一种新型的简化检测技术，可用于抗原、抗体及半抗原的定性、半定量及定量检测，具有简便、特异、快速、敏感的特点，且不依赖于专业技术人员及昂贵的仪器设备［1］。试纸由样品垫、胶金垫、NC膜及吸水纸等材料依附在有一定硬度的支架上组成，对样品进行检测时，在吸水纸的吸引作用及毛细管作用下，液体样品依次通过样品垫、胶金垫、NC膜，到达吸水纸端。NC膜上固化有两道线：检测线和质控线。质控线显色指示测试有效，检测线则根据检测模式的不同而呈现红色或不显色，以指示阳性或阴性结果。免疫层析试纸的检测原理主要有两种：夹心法和竞争法。利用夹心法检测时，胶体金标记的抗体或抗原与相应的被检测物（analyte）结合后，可以被检测线上的另外一株抗体拦截显色，同时多余的金标抗体或金标抗原被质控线上的抗体拦截显色。若样品中不含被检测物，则不能与金标抗体或金标抗原结合，不被检测线拦截显色，而质控线上的抗体则与金标抗体或抗原结合显色。即阴性样品仅有质控线显色，检测线不显色；阳性样品在检测线和质控线同时显色［2］。利用竞争法检测时，当样品中的被检测物与金标抗体结合后，就能阻断金标抗体与检测线上的固化物（BSA-analyte）结合，此时胶体金颗粒不在检测线上聚集，也就不显色，多余的金标抗体与质控线上的抗体结合，使金颗粒聚集显色。而如果样品中不含有被检测物，那么也就不能阻断金标抗体与检测线上的固化物结合，此时检测线上将发生胶体金的聚集显色，同样，质控线也因金颗粒的聚集而显色；即检测阴性样品时，结果同时出现检测线和质控线；检测阳性样品时，仅出现质控线，不出现检测线，与夹心法的结果判定恰恰相反［3］。试纸检测的样品类型包括血液、尿液、乳液、口腔液等，可用于食品及水质安全检测、环境监测、传染病检测及慢性非传染性疾病检测。

1 胶体金试纸检测

传统的即时检测试纸主要以胶体金作为标记物，以检测线和质控线的显色情况及强度进行定性和半定量检测，已在抗原检测、抗体检测和半抗原检测领域发挥显著作用。

1.1 抗原检测 抗原检测试纸的检测靶标可以是微生物抗原，如病毒、细菌以及非微生物抗原，如自身抗原、肿瘤抗原等。常见的检测模式有3种：①金标单抗，多抗拦截；②金标多抗，单抗拦截；③金标单抗，识别不同位点的单抗拦截。最早出现的抗原检测试纸主要是针对人绒毛膜促性腺素（human chorionic gonadotropin，HCG）、A群链球菌及衣原体的检测［4］。近年来，免疫层析试纸检测技术被广泛应用于传染病病原体、肿瘤及心血管疾病检测方面。Reid等制备了检测口蹄疫病毒的层析试纸，可检测7种血清型的口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease viruses，FMDV）［5］。Niu等制备了检测食物中金黄色葡萄球菌的试纸，检测限达103 CFU·mL-1，可快速评价食品及水质安全［6］。Gholamzad等分别利用双抗体夹心法和竞争法建立了检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的胶体金检测试纸，检测限分别达到10 ng·mL-1和 25 ng· mL-1［7］。Ma等 制 备 了 用 于 检 测HIV-1 p24抗原的胶体金试纸，检测限达25 pg·mL-1，为HIV感染的早期诊断提供了高效便捷的方法［8］。Wu等利用双抗体夹心法制备了检测前列腺特异抗原（prostate-specific antigen，PSA）的胶体金试纸，可作为监测前列腺癌病情变化和疗效观察的有效工具［9］。

1.2 抗体检测 抗体检测试纸的检测靶标一般为IgA、IgG及IgE等。常见的检测模式有两种：①金标抗原，二抗／SPA拦截；②金标 SPA或二抗，抗原拦截。Yang等利用金标蛋白抗原或多肽建立了检测O型FMDV病毒抗体的胶体金试纸检测方法，其中金标多肽检测试纸可特异区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体［10-11］。Cheng等以金标二抗，抗原拦截的模式建立了检测H5和H6亚型禽流感抗体的胶体金试纸诊断方法，与血凝抑制试验符合率非常高［12］。Zhang等制备了检测血清旋毛虫抗体的胶体金试纸，利用结合哺乳动物IgG的SPA作为拦截线，可检测人、宠物、动物血清旋毛虫抗体［13］。Xiang等表达了丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）不同的蛋白抗原，以高免疫原性的蛋白抗原建立了双抗原夹心胶体金试纸用于HCV抗体的检测，为临床监测HCV感染提供了简便方法［14］。

1.3 半抗原检测 半抗原检测试纸的检测靶标通常为抗生素、农药、兽药、生物毒素、激素等小分子物质。常见的检测模式有两种：①金标单抗，人工抗原拦截；②金标人工抗原，单抗拦截。利用竞争法原理，张改平等制备了检测盐酸克伦特罗、沙丁胺醇等β-激动剂的胶体金试纸条，实现了对此类瘦肉精产品的定性及半定量检测［15］。Li等建立了检测苯乙醇胺A的胶体金快速检测方法，因筛选的单抗具有高亲和力，使得检测限达 0.1 ng·mL-1［16］。Wang等建立了半定量检测奶粉中大豆致敏蛋白glycinin和β-conglycinin的试纸检测技术［17］。Hua等建立了检测农产品中8种有机磷农药的胶体金试纸检测方法［18］。近来，用于细菌性疾病治疗的抗生素残留问题越来越受到重视，因此研究人员先后制备了检测庆大霉素、四环素、氯霉素、氟苯尼考等抗生素的胶体金试纸［19-21］。谷物中极低浓度真菌毒素即可对人或动物机体产生毒害，Sun等制备了可同时检测谷物中赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的胶体金免疫层析试纸［22］。

1.4 其他检测 除对抗原、抗体及半抗原进行检测外，免疫层析试纸在其他检测领域，尤其是对金属离子及核酸检测方面也存在广泛应用。Tang等以竞争法模式建立了检测水中重金属铅的胶体金试纸检测方法，检测限达50 ng·mL-1，该法需要 TiO2对样品中的铅进行富集［23］。Liu等制备了检测水样及血液样品中铬离子Cr3+的胶体金试纸，检测时需要通过预处理将样品中Cr6+的还原为Cr3+，定性检测限达50 ng·mL-1，定量检测的线性范围为 5～80 ng·mL-1［24］。核酸检测包括 3个主要步骤：样品制备（核酸提取与纯化）、扩增（PCR／LAMP）及检测（荧光信号、浊度），将其检测步骤与免疫层析试纸结合可制备出核酸检测试纸（nucleic acid lateral flow，NALF）［25］。核酸试纸检测存在抗体依赖和抗体非依赖两种模式。抗体依赖模式建立在夹心法基础上，首先使用两种小分子半抗原，硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）和生物素（Biotin）分别标记上下游扩增引物，再使用对应的抗体作为金标抗体及检测线上的拦截抗体。抗体非依赖模式则利用金标寡核苷酸与检测线上的寡核苷酸分别结合扩增片段的两端，扩增产物仅需在室温条件下与金标寡核苷酸进行3 min孵育杂交即可用于检测［26］。Roskos等利用亲和素标记纳米微球，生物素和地高辛标记引物，抗地高辛抗体作为检测线制备了检测结核分枝杆菌基因组DNA的试纸，并且将63℃的LAMP扩增与试纸整合形成了可移动小型设备，为核酸即时检测提供了更方便快速的方法［27］。

2 新型试纸检测

现有的胶体金试纸检测存在两个局限：一是定量检测受限；二是敏感性稍低。克服两个局限的方法有：①筛选利用高亲和力的单抗；②利用更为敏感的纳米材料作为标记物；③利用更为精密的试纸信号读取仪；④利用新的显色增强策略。新型试纸检测技术主要针对传统试纸的这两种局限而不断改良，向着多靶标、定量、高敏感性检测方向发展。已用于提高试纸检测敏感性的新材料有：磁颗粒、荧光微球、量子点、上转换荧光粉、碳纳米颗粒、铕纳米颗粒等；此类免疫层析技术虽然需要使用配套的仪器对结果信号（磁信号、电化学信号、化学发光信号、荧光信号）进行读取，但可在不影响特异性的前提下，显著提升敏感性，而且可实现定量的检测分析。试纸阅读仪通过将检测线和质控线的颜色强度转变为光密度值实现定量分析。鉴于被分析物浓度、反应时间和温度对结果的影响较大，故通常采用检测线光密度与质控线光密度的比值进行定量判定［28］。Hou等使用智能手机作为试纸阅读器实现了对HCG抗原和癌胚抗原的检测，该模式既可以利用LED依据颜色变化判定结果，又可以利用UV-LED结合内置软件进行定量分析［29］。

Zhao等利用红外—可见光上转换材料标记单抗，以竞争法模式制备了检测作物中黄曲霉毒素AFB1的定量检测试纸，检测限（0.03 ng·mL-1）比常规胶体金试纸（0.25 ng·mL-1）低近 10倍［30］。Sakurai等利用荧光微球（fluorescent beads）标记单抗建立的试纸检测方法可以对鼻拭子样品对季节性流感进行快速分型并且可检测大多数H5亚型的流感病毒，检测敏感度较胶体金标记的试纸检测方法提高 10～100倍［31-32］。

Taranova等利用多色（红绿黄）量子点建立了检测牛奶中氧氟沙星、氯霉素、链霉素三类抗生素的多联试纸检测方法（含3道 T线），既可以根据类似于交通信号灯一样的颜色变化进行定性判定，又可以通过测量荧光强度实现定量检测，三类抗生素检测限分别达 0.3 ng·mL-1、0.12 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1，比酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）敏感 80～200倍［33］。Wang等利用多色量子点标记不同单抗，喷附两种单抗混合物作为T线，通过检测量子点荧光强度建立了定量多联检测多种肿瘤标志物的试纸检测方法，对甲种胎儿球蛋白和癌胚抗原的检测限分别达到了3 ng·mL-1和2 ng·mL-1。作者提出将T线加宽并使用双层结合垫（conjugate pad）可实现对3种及3种以上肿瘤标志物进行多联定量检测［34］。

Chen等利用超顺磁性纳米颗粒标记单抗，以双抗体夹心法制备了检测肿瘤标志物——糖类抗原72-4（carbohydrate antigen 72-4，CA 72-4）的磁性免疫层析试纸，既可以肉眼判定结果，也可以使用测定器（magnetic assay reader，MAR）检测磁性强度进行定量分析，检测限达 0.38 IU·mL-1［35］。Duan等利用Fe3O4磁纳米颗粒代替胶体金制备了纳米酶试纸条，应用于埃博拉病毒（Ebola virus，EBOV）GP蛋白的检测，比常规试纸检测敏感度提升100倍，对新布尼亚病毒的检测敏感度与 ELISA相当［36］。该试纸既可以通过磁纳米颗粒分离富集样品，又可以利用磁纳米颗粒的类过氧化物酶活性催化DAB、TMB、AEC等底物增强显色。

Song等首先向细菌培养物中加入FITC，非特异性地标记O157型大肠杆菌，再利用FITC标记的特异性抗体及T线上的特异性单抗建立了检测大肠杆菌O157型的试纸检测方法，使得检测线出现了FITC的荧光信号增强效果，检测敏感度比常规胶体金试纸高10倍，与 ELISA相当［37］。

Hwang等将拉曼讯号分子（Raman reporter）如Cy5修饰到中空的金纳米颗粒表面再与单抗进行标记，制备了表面增强拉曼光谱标记偶联物用于葡萄球菌肠毒素 B（staphylococcal enterotoxin B，SEB）的检测，检测限低达0.001 ng·mL-1，比常规ELISA检测方法低3个数量级［38］。SEB是一种热稳定型肠毒素，剂量低于1 ng·mL-1即可造成中毒。使用小型轻便的拉曼光谱计进行阅读，真正实现了既具高敏感性又能定量地检测。Yao等则将荧光染料Cy5修饰的单抗用作检测线，使用胶体金标记单抗检测癌胚抗原，检测结果既可通过颜色变化进行定性判定，又可通过检测Cy5荧光的淬灭进行定量分析。该方法与以往尝试给单抗负载更多的Cy5以提高试纸检测敏感性的方式不同，它利用的是胶体金纳米颗粒的荧光淬灭能力，与传统试纸检测方式相比，该法可将检测敏感度提高2个数量级［39］。

Han等制备了可定性及半定量检测动物体液（血液、尿液、乳液）中存在的三类（β-激动剂、磺胺类、四环素类）26种药物的胶体金多联检测试纸（含3道T线）。他采用冻干的金标单抗而非直接喷附在胶金垫上的模式，这使得金标单抗与样品中的被分析物有充分的结合时间，从而也使检测敏感度提高了 10倍［40］。

Kuang等制备了用于检测饮用水中重金属铅的显色增强型的免疫层析试纸，比常规竞争法检测试纸敏感度提升 4倍，检测限达 0.19 ng·mL-1［41］。该检测方法不需要采用TiO2对样品中的铅进行富集，采用较大金纳米颗粒标记山羊抗小鼠抗体作为增强信号，以较小金纳米颗粒标记OVA单抗及重金属铅单抗，较小的金纳米颗粒流动较快，当其被检测线捕获后，会出现显色，当较大的金标山羊抗小鼠抗体流动到检测线时会与已结合的金标单抗反应，从而实现信号增强。

Wang等将拉曼讯号分子异硫氰基—孔雀石绿修饰到中空的金纳米颗粒表面，金标特异性的核酸探针，以生物素标记的引物进行核酸扩增，链霉素标记的特异寡核苷酸作为检测线，建立了检测Kaposi肉瘤相关疱疹病毒DNA和杆菌性血管瘤病DNA的多联试纸，检测敏感度比利用金纳米颗粒及银纳米颗粒建立的多联检测试纸高1万倍［42］。

鉴于肿瘤特异性标志物的缺乏，Warren分别利用血浆凝血酶和间质金属蛋白酶多肽底物将PEG包裹的氧化铁纳米颗粒与生物素标记的荧光素进行连接，通过静脉注射进入小鼠体内，30 min后收集尿液，利用免疫层析试纸进行检测，最低检测限低于1 nM，实现了对血栓塞及直肠癌的筛查［43］。

3 结语

免疫层析试纸检测具有轻简、快速、特异、敏感等特点，非常适用于现场检测和即时检测，已在抗原、抗体及半抗原检测领域取得显著成绩。未来试纸检测技术的发展要在保证传统优势的基础上，利用新材料、新的设计策略向更高敏感性、定量、多联检测方向发展，试纸的数字化检测可以在互联网+时代背景下对大规模群体实施检测，获取大数据，用于建立预警评价信息平台。

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Research Advance of Immunochromatographic Strip Test

WANG Yin-biao1，2，LIU Xiao2，LI Qing-mei2，GUO Jun-qing2
（1.School of Public Health，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China；2.Henan Academy of Agricultural Sciences，Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China）

R115；R446.6

A

1672-688X（2017）03-0236-05

10.15926／j.cnki.issn1672-688x.2017.03.022

国家重点研发计划（2016YFD0500700）

2017-06-12

1.新乡医学院公共卫生学院，河南新乡453003 2.河南省农业科学院，河南省动物免疫学重点实验室，河南郑州450002

王寅彪（1986—），男，河南新乡人，博士，讲师，从事卫生检验与检疫工作。

郭军庆，男，博士，研究员，E-mail：guojunqing2008＠gmail.com