血浆ctDNA在卵巢上皮恶性肿瘤的早起诊断与疗效研究

杨丽娜，徐 琳，高玉涛

（昆明医科大学第一附属医院 ，云南 昆明 650032）

血浆ctDNA在卵巢上皮恶性肿瘤的早起诊断与疗效研究

杨丽娜，徐 琳，高玉涛

（昆明医科大学第一附属医院 ，云南 昆明 650032）

卵巢上皮性癌是常见的妇科恶性肿瘤，早期诊断非常困难，70%以上的患者就诊时已属晚期，5年生存率滞留在30%左右。早发现、早诊断、早治疗对卵巢癌的预后至关重要。卵巢癌的早期诊断、疗效评估多依靠肿瘤标志物，但敏感性和特异性均不够理想。故寻求理想的标记物早期诊断、评估化疗的敏感性，对提高临床疗效具有重要意义。ctDNA是肿瘤细胞脱落或凋亡后释放进入循环系统的DNA片段。有文献证明在肿瘤患者中ctDNA可以被定性、定量和追踪，可以用于肿瘤的早期发现和治疗评估。

血浆ctDNA；肿瘤；卵巢癌；早期诊断；疗效评价

血浆游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）是外周血中游离存在、不包含在完整细胞结构内的DNA。循环系统中存在cfDNA早已得到证实。目前，cfDNA可能来源于以下三种情况：①来自于细胞的凋亡进程中片段化的DNA；②来自于坏死的细胞的DNA碎片；③来自于细胞分泌的exosome。其中，cfDNA主要来源于细胞凋亡。而国内ctDNA 在妇科恶性肿瘤中的相关研究极少。本实验通过对比肿瘤组织及外周血ctDNA基因突变，评估早期诊断的可行性，提高卵巢癌早期检测的灵敏度、特异性。并对治疗前后患者外周血ctDNA变化情况进行监测，探寻一种可以预测治疗效果的方法[1-2]。对于早期诊断卵巢癌，选择最佳的、个性化的治疗方案及判断预后有非常重要的价值。

1 立项依据与研究内容

项目的立项依据，研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。卵巢上皮性癌是常见的妇科恶性肿瘤，死亡率居妇科恶性肿瘤的首位。早期缺乏特异性的腹盆腔症状和敏感标记物使得卵巢癌的早期诊断非常困难，70%以上的患者就诊时已属晚期，其5 年生存率仍然滞留在30%左右。早发现、早诊断、早治疗是卵巢癌治疗的关键。卵巢癌的早期诊断、疗效评估多依靠肿瘤标志物，如CA125和HE4，但现有的肿瘤标志物敏感性和特异性均不够理想。故寻求理想的肿瘤标记物早期诊断并有效地预估卵巢癌对化疗的敏感性，实现个性化方案，对提高临床疗效颇具意义。ctDNA（Circulating tumor DNA），是原发肿瘤甚至是转移形成的新肿瘤上的细胞脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统的DNA 片段。在肿瘤形成早期，血液中已经开始有ctDNA 了，有多篇文献证明在多种肿瘤患者中ctDNA可以被定性、定量和追踪，可以用于肿瘤的早期发现和治疗评估。2015 年发表于《Nature Communications》杂志的一项新的研究，Mark Sausen 等[3]首次发现，流进入血液中的肿瘤DNA，可用于实时跟踪胰腺癌的发展以及对治疗的反应。在非小细胞肺癌方面，ctDNA 研究颇多，如有学者研究[4]显示ctDNA 浓度水平可真实反映经不同手段治疗的早期或晚期非小细胞肺癌肿瘤负荷变化。ctDNA 有望成为恶性肿瘤早期诊断和疗效判断的新型肿瘤分子生物学标志物。在诸多肿瘤ctDNA 研究方面，ctDNA 在卵巢癌方面的研究国外报道较少，如有学者研究[5]显示ctDNA 在7 例III 期卵巢癌患者的血浆中均可检测到。而目前国内ctDNA 在卵巢癌方面的相关研究尚未见报道。卵巢上皮癌死亡率在妇科肿瘤中占第一位，为降低卵巢癌的死亡率，改善卵巢癌患者的预后，迫切需要积累更多相关数据来明确ctDNA 在卵巢癌早筛、疗效监测、预测疾病复发以及化疗耐药甚至靶向治疗方面的作用和价值。

2 研究内容

2.1 明确ctDNA 在卵巢癌的早期诊断方面的价值；

2.2 卵巢上皮性癌患者术前、术后、化疗过程中、化疗后、随访中、复发时等不同时间点ctDNA 含量的变化；

2.3 ctDNA 含量与卵巢癌手术病理分期、肿瘤大小、肿瘤级别等临床病理参数之的相关性；

2.4 ctDNA 含量与化疗效果及肿瘤预后的相关性；

2.5 ctDNA 水平和肿瘤大小(用超声和CT 评估) 之间的相关性；

2.6 ctDNA 预测上皮性卵巢癌复发的敏感性和特异性；

2.7 对肿瘤组织和血液样本进行基因筛查和对比，确定卵巢癌的基因型；

3 研究方法

卵巢癌患者ctDNA 检测样本的获取：卵巢癌患者术前、术后、化疗过程中、化疗后、复发时的血样均于清晨空腹时抽取肘静脉血10ml 于EDTA 抗凝管中，并在30 分钟至 2 h 内做以下 2 步处理：

1）在4℃条件下1800 g 离心 10 min，离心后将上清（血浆）分装到多个 2.0 ml 的离心管中。下层血细胞分装到 2 ml 冻存管中，即为所需血细胞；

2）在4℃条件下以 16000 g 离心 10 min 去除残余细胞，将上清转入新的 2.0 ml 的离心管中，即得到所需的血浆。而后将样品保存到-80℃冰箱中或干冰中待测定。

4 本项目的特色与创新之处

4.1 通过定性、定量和追踪ctDNA，探索通过ctDNA 进行卵巢癌早期诊断及疗效评价的可能机制。

4.2 癌症个体化深度测序分析方法是目前液态检测的一种新方法，其在卵巢癌中的相关研究鲜有报道。

4.3 目前肿瘤治疗已经进入靶向治疗的新时期，卵巢癌Brca 基因突变靶向治疗初现端倪，本实验应用ctDNA 检测肿瘤的突变位点，寻找新的靶向治疗位点的可能。

5 总 结

ctDNA，ctDNA中检测出的基因变异（EGFR或者ALK）是否可以直接指导临床治疗，我们需要进一步的数据来证实；EGFR突变患者使用靶向治疗耐药的过程中，RECIST标准往往评价不够完整，如何通过血液监测耐药突变（T790M）的丰度来指导我们的耐药，也非常值得临床探索。在将来，随着我们检测方法的不断进步，期待液态活检技术能够真正应用到临床，指导肺瘤精准治疗，成为延长患者生存期的必备手段！

[1] Dawson SJ, Tsui DW, Murtaza M, et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitormetastatic breast cancer. N Engl J Med.2013;368:1199–1209.

[2] Garcia-Murillas I, Schiavon G, Weigelt B, Ng C, Hrebien S, Cutts RJ, Cheang M, Osin P,Nerurkar A, Kozarewa I et al: Mutation tracking in circulating tumor DNA predicts relapse in earlybreast cancer. Sci Transl Med 2015, 7(302):302ra133.

[3] Sausen M, Phallen J, Adleff V, et al. Clinical implications of genomic alterations in the tumourand circulation of pancreatic cancer patients. Nature communications. 2015;6:7686.

[4] 高玉涛,吴令英,张 伟,等.三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验指导复发性卵巢上皮性癌化疗的前瞻性研究[J].中华妇产科杂志,2013,48(5):358-363.

[5] 徐 琳,王 艳,韩雪松,等.超声消融治疗大于45 岁子宫肌瘤患者后性激素变化分析[J]. 云南医药,2016,(02):172-175.

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ISSN.2095-8803.2017.24.075.02