Cathelicidins结构与功能的关系及其分子设计研究进展

王晨，冯兰，于海宁，王义鹏

1 大连理工大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024 2 苏州大学 药学院，江苏 苏州 215123

Cathelicidins结构与功能的关系及其分子设计研究进展

王晨1，冯兰1，于海宁1，王义鹏2

1 大连理工大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024 2 苏州大学 药学院，江苏 苏州 215123

Cathelicidins作为大多数脊椎动物所特有的宿主防御肽，除了具有高效广谱的抗菌活性外，还具有如抗炎症、伤口修复、抑制组织损伤和促进血管生成等重要活性，因此成为蛋白多肽类新药研发热点。近年来，以其为模板进行的结构改造主要有以下几类：通过点突变、氨基酸替换、活性片段拼接、化学修饰以及轭合物和二聚体构建等手段提高cathelicidins的生物学活性；通过添加或删减氨基酸残基和破坏Leu和Phe拉链结构等手段可以降低cathelicidins的细胞毒性和溶血活性；通过D-型氨基酸替换L-型氨基酸、构建环形和固位型cathelicidins的方式增强其体内外稳定性等。

Cathelicidins，结构，功能，分子设计，稳定性

当今抗生素的过度滥用引起的多重耐药菌感染导致每年至少有25 000名患者死亡，因此寻找传统抗生素的替代品已成为医学界急需解决的难题[1–3]。脊椎动物所特有的宿主防御肽cathelicidins (CATHs) 由于具有高效广谱的抗菌活性，以及抑制组织损伤、抗炎症、伤口修复和促进血管生成等一系列免疫调节活性，成为蛋白多肽类新药尤其是新型抗生素的研发热点。然而，生物活性不够强、具有溶血及细胞毒性、容易被蛋白酶降解等缺点却限制了其广泛应用。因此以cathelicidins为模板进行的分子设计与改造近年也有了很快发展。

1 Cathelicidin简介

CATHs是一类广泛存在于脊椎动物体内的宿主防御肽，其前体由 N-端信号肽、高度保守的cathelin区和高度特异的C-末端成熟肽构成，具有广谱抗菌活性[4]。常见CATHs二级结构有α螺旋、β折叠、延伸-螺旋和不太多见的环状结构[5]。1) α-螺旋类CATHs：分子结构以α螺旋为主，具有很好的两亲性，通常无分子内二硫键，N-端含有较多的亲水氨基酸，C-端富含疏水氨基酸。人源LL-37为此类的典型代表[6]。2) β-折叠类CATHs：具有反向平行的β折叠结构，其分子内有4个保守的Cys可形成2个二硫键，可起到稳定多肽结构的作用，如猪 CATHs: PG-1b、PG-2b、PG-3b、PG-4b和 PG-5b等[7]。3) 延伸-螺旋型CATHs：该类CATHs不形成典型的二级结构，也不形成分子内二硫键，但是通常富含某些特定的氨基酸残基 (AA)，如：Arg、Trp和 Pro。常见的有富含 Arg和 Pro的PR-39[8]以及富含 Trp的 Indolicidin[9]。4) 环状CATHs：分子内含有一个二硫键，整体呈现环链结构，大多两栖类蛙来源的CATHs，还有绵羊的OaDode和牛的Dodecapeptide[10]均为此结构。本文将针对不同 CATHs的结构与功能、作用机制与成药性特征进行的结构改造手段进行综述。

2 Cathelicidins杀菌机理及特点

大部分CATHs家族抗菌肽具有两亲性的α-螺旋结构并且富含带正电荷的AA。含有磷壁酸的革兰氏阳性菌 (G+菌) 细胞壁以及含有脂多糖的革兰氏阴性菌 (G–菌) 细胞壁均带负电荷，而带正电荷的CATHs可以首先通过静电吸附聚集至细菌表面，进而发挥破坏微生物膜形态的作用[11]。虽然目前作用机制仍不明确，但普遍推测此类抗菌肽可以通过“地毯”或者“桶板”模型两种机制破坏微生物细胞膜，发挥抗菌作用。“地毯”模型通常需要 CATHs富含正电荷AA，但不需要具有特定的二级结构。阳离子CATHs与细菌细胞膜的磷脂双分子层中带负电的磷脂分子头基相互静电吸引，CATHs以地毯式覆盖在细菌细胞膜表面，通过转动最终使亲水侧朝向磷脂分子头基，疏水侧朝向疏水核心破坏细胞膜，导致细菌裂解死亡，如LL-37[12]。与“地毯”模型不同的是，“桶板”模型既需要CATHs富含阳离子又需要特定的二级结构使其具有两亲性，如 α-螺旋和 β-折叠。在此模型中CATHs相互识别并聚集在细菌细胞膜表面，亲水区域与磷脂头基相互吸引，疏水区域与细胞膜的疏水核心相互作用，最终在膜上形成孔洞，引起细菌死亡[13]。

除了对细胞膜的破坏作用，一些CATHs可以通过干扰细菌的正常生理功能来发挥抗菌作用，例如：阻断DNA合成、影响RNA转录、干扰蛋白的加工折叠以及阻断能量供应和营养物质吸收等[14]。而传统抗生素大多数是通过与微生物的酶发生作用，干扰其正常的生命活动，需要较长时间才能发挥作用。因而CATHs作为新药模板或新型抗生素替代品的优势是：1) 抗菌谱广，对G+菌、G-菌、真菌、霉菌、原虫和部分有包膜病毒均有活性。2) 抗菌活性强，最小抑菌浓度 (MIC)可以达到 nmol/L水平,且杀菌作用迅速。2) 不易诱导微生物产生耐药性，对大量临床耐药菌株，甚至是超级耐药菌，具有非常强的活性[15–16]。3) 低溶血性及细胞毒

性[17–18]。4) 相对于溶菌酶和防御素等蛋白类抗生素，分子量小，不含有二硫键，结构简单。5) 生产工艺简单，成本低。6) 除了直接的抑菌杀菌活性外，还具有多种免疫调节活性[19–20]。

3 Cathelicidins的结构改造与策略

虽然CATHs家族活性肽具有以上的优势，但某些特点仍然限制了其广泛应用。由结构特点所致的强抗菌活性通常伴随着较强的溶血活性；且蛋白的稳定性低，容易被蛋白酶水解等。因此针对该家族肽的结构改造一直是相关领域研究热点。

3.1 提高CATHs生物活性的改造

3.1.1 氨基酸替换法

替换天然CATHs某些特定的氨基酸残基是增强其抗菌活性的重要手段。早在 2005年Hilpert等发现将具有典型的 α-螺旋结构牛CATH-Bac2A的第3位Ala替换为Trp，得到的W3抗菌活性提高了6-8倍[21]。随后Zhu等在对猪 CATH、PMAP-36的研究中，先截取PMAP-36的α螺旋区域得到RI16，然后用Trp替换成对存在的带正电荷的AA (Lys 和Ar) 分别得到PRW3、PRW4、PRW5和PRW6，抗菌活性提高了8-16倍[22]，原因可能为RI16含有较多的Lys和Arg，而Trp的侧链为被带负电荷π电子云环绕的吲哚基，吲哚基的存在有助于使得带正电荷的基团渗入到细胞膜的双分子层中，进而使疏水面更深地插入到细菌细胞膜中破坏其完整性。Concetta等用疏水性较强的Ala替代欧洲林蛙来源的Temporin-B中疏水较弱的Gly，得到的衍生物对 G+菌的抗菌活性明显增强；把来自黑龙江林蛙的Temporin-1Ceb α-螺旋的亲水面5-6个非极性氨基酸替换为Lys，改造体抗菌活性提高了 10-40倍[23]，原因可能是提高了抗菌肽的阳离子性和两亲性。

3.1.2 片段拼接法

将CATHs活性区域与同家族或者其他活性肽的活性区域直接进行拼接也是提高CATHs抗菌活性、或引入其他性能的常见手段。鉴于CATHs结构与功能关系，常利用截短改造的方法可得到其活性区域。PMAP-36由36个AA组成，Lv等舍去C端12个AA仅保留N端24个AA，其截短产物GI24的抗菌活性与PMAP-36活性一致[24]。人LL-37的只含19个AA的截短产物 IG-19仍然具有很强的抗菌活性[25]。对鸡的cathelicidin-2 (CATH-2) 进行截短改造，仅保留C11-21，仍然有很好的抗菌活性[26]。

将 2个以上活性截断体拼接后往往会得到具有所有截短体活性特征的拼接体。将LL-37 α螺旋区分别与 magainin II、magainin II (alaninated) 和cecropin A的活性区域进行拼接分别得到MALL、LLaMA和CaLL。其中LLaMA和CaLL具有很好的抗菌活性，尤其是CaLL的活性更加突出[27]。Ma等将猪源 PMAP-36的改造产物PRW-4与鸡fowlicidin-2的α螺旋区域进行拼接得到PR-FO；将PRW-4与protegrin-3的β折叠区域进行重组得到PR-PG；将PRW-4与tritrpticin的活性区域结合得到 PR-TR，与模板肽相比这 3条重组肽的抗菌活性尤其是对耐药菌的活性，得到了明显提升。其中PR-FO活性最好，抗菌活性提高了近 13倍[28]。我们将海蛇Hc-CATH活性区域Hc3截断后与trpsin inhibitor loop、ORB-C双向拼接，再通过关键残基替换，得到4个改造体，与Hc3相比，不仅保留了强抗菌抗炎活性，低溶血低毒性，更极大提高了对理化条件 (NaCl、pH和血清等) 及蛋白酶的稳定性。

3.1.3 化学修饰法

对天然CATHs进行化学修饰也是增强其抗菌活性的常见手段。LL-37的改造体，17F2 (GX1KRLVQRLKDX2LRNLV，X1X2均为Phe，Leu为D型氨基酸)，在模拟膜环境中的高级结构为非典型的两亲结构，无粘聚力的侧链，造成了其结构上的疏水缺陷。通过引入更大的疏水化学基团的填充17F2的疏水凹槽，以增强其抗菌活性。4-三氟甲基苯基丙氨酸(4-triuoromethyl phenyl alanine)、2-萘基丙氨酸(2-naphthylalanine) 和联苯基丙氨酸(Biphenylalanine)均为氨基酸类似物，也可以看作 Ala的侧链经疏水基团修饰的产物。在检测的 6株菌株中，无修饰的17F2仅对3株表现出抗菌活性，而修饰的改造体对 6株菌均有抗菌活性且抗菌活性得到很大提升，其中17BIPHE2活性最好。后续研究中还发现17F2和6种化学修饰改造体除了通过破坏细菌细胞膜完整性从而发挥其抗菌活性，还能够进入细胞与DNA结合，并且抗菌活性与DNA结合能力呈正相关[29]。因而推测化学修饰增强活性的原因可能是提高了CATHs的两亲性和DNA结合能力。

3.1.4 二聚体的构建

一些含有 Cys的抗菌肽能够形成由二硫键连接的二聚体，使得生物活性明显提高。此种手段也可应用于含有 Cys的 CATHs的优化改造。实验表明二聚化的 LLP1、Analogue 5、magG3C和TL1的抗菌活性均得到明显提升，最高提升了16倍[30]。同时还发现LLP1的单体和二聚体形式的二级结构均为 α-螺旋，说明二硫键不会改变多肽原有的二级结构。二聚化也可能提高抗菌肽的其他一些生物活性，比如PST13-RK (一类 β-转角抗菌肽) 经二聚化修饰后，其抗癌活性明显提高[31]。

3.1.5 轭合物的构建

该类CATHs的组成模式为：CATH-连接体-功能域，其中CATHs行使杀灭微生物的功能，功能域能够识别特定的微生物，连接体将二者连接。连接体区域通常形成绞链区，功能域为非线性肽或者非肽类分子。SMAP-28是来自绵羊的 α-螺旋 CATH，用马来酰亚胺作为连接体将其与牙龈卟啉单胞菌Porphyromonas gingivalis菌株表面特异性抗体IgG进行连接可形成一种轭合物，这种改造体在低浓度条件下 (20 μg/mL) 可选择性杀灭 P．gingivalis，而对伴放线放线杆菌Aggregatibacter actinomycetemcomitans和微小消化链球菌Peptostreptococcus micros不表现出抗菌活性，但在高浓度条件下 (50 μg/mL)，对 3种试验菌均表现出杀灭活性[32]。

将功能域换为靶向体，将得到另一类轭合物：CATHs-连接体-靶向体。靶向体是一类能够识别特定病原菌的区域，与功能域不同的是该区域为线性肽。与之类似的是特异性靶向抗菌肽 (Specifically targeted antimicrobial peptides, STAMPs)[33]，这种构建方式将致病菌信息素末端的氨基酸序列整合到抗菌肽上，使整个分子可以被信息素感受器识别，从而更加有效地破坏特定微生物的细胞膜，将其杀灭[34]。该类CATHs在多种细菌共栖的环境中，可以选择性地杀灭有害微生物，在维持动物肠道健康方面有着得天独厚的优势。

富含Lys的抗菌肽与抗生素新霉素B可形成轭合物，也可应用于对CATHs的改造研究中。Bera对该轭合物的杀菌活性研究结果表明，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus的活性较肽和新霉素相比提高了 8倍，但杀灭其他革兰氏阳性菌的活性却有所下降，同时对革兰氏阴性菌的活性提升较为明显，与新霉素和肽相比分别提升了4-8倍和12倍[35]。

将脂肪酸与抗菌肽相连也可增强抗菌活性。脂肪酸链的长度不超过16个时，其抗菌活性与脂肪酸链碳原子数呈正相关[36]，机制可能为脂肪酸链增加了肽的疏水性，从而加强了其与膜的亲和性进一步提高了抗菌活性。

将CATHs作为佐剂，与抗原形成的轭合物，还能够提高机体的免疫反应。将编码 LL-37的基因与编码巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFRJ6-1)的基因进行融合表达，表达得到的轭合物能够高效诱导免疫反应，刺激脾脏细胞分泌 IFN-γ和 IL-4，并且能够延长接种P2/0-CSFRJ6-1肿瘤细胞小鼠的寿命[37]。

3.2 提高CATHs细胞选择性的改造

3.2.1 点突变

猪Tritrpticin富含Arg和Trp，具有很强的抗菌活性，但是溶血性较高，对真核细胞的杀伤作用成为阻碍其临床应用的障碍之一。将Tritrpticin的所有Arg替换为Lys得到TRK，虽然抗菌活性仅略微提升，但溶血活性降低近 40倍[38]。羊Ovispirin-1是SMAP-29的前体，具有很强的抗菌活性但同时也具有很强的人上皮细胞有毒性，人红细胞溶血性。在保留Ovispirin-1两亲性的基础上，用弱疏水的Gly取代第10位强疏水的Ile，得到Ovispirin G-10，保留其抗菌活性的基础上，溶血活性降至仅2.5%，同时对子宫细胞ME-80和肺癌细胞A-549的细胞毒性也极大降低，原因是降低了强疏水氨基酸的比例[39]。

3.2.2 破坏Leu和Phe拉链结构

牛BMAP-27具有广谱的抗菌活性和中度溶血活性。其二级结构为 α-螺旋，N-端含有较多的Leu，C-端含有较多的Phe，分别位于a位点和d位点，几乎在α-螺旋的一侧排列，因而在N-端和C-端分别形成Leu拉链和Phe拉链结构，该结构与溶血活性密切相关。将位于a位点和d位点的Phe和Leu用Ala替代，可以破坏拉链结构得到 4条改造体，对人血红细胞的溶血活性几乎消失，而原始肽在浓度为50 μmol/L条件下溶血率在 20%以上[40]。研究还发现改造体对鼠的3T3细胞的细胞毒也明显低于原始肽。

3.3 提高CATHs稳定性

作为蛋白多肽类药物，CATHs也面临被环境中、动物体内的蛋白酶家族水解的难题。如何提高其酶稳定性是蛋白类药物应用亟待解决的首要难题[41]。

3.3.1 D-型氨基酸替换L-型氨基酸

将GF-17 (LL-37的C17-32片段) 的20、24和 28位 AA替换为 D-型氨基酸，得到的GF-17d3，在与糜蛋白酶共孵育后仍具有抗菌活性。说明GF-17d在存在糜蛋白酶的环境中有较好的稳定性。但若只替换第20位氨基酸或者第20、24位的L-型Ile为D-Ile，则对糜蛋白酶的稳定性没有明显的改变[42]。在本次研究中虽然用D-型氨基酸替换相应的L-型氨基酸可以提高CATHs的稳定性，但其抗菌活性却不如原始肽。Mathison等研究者发现将鼠FEG的所有氨基酸残基由L-型转变为D-型后，抗蛋白酶解能力显著提升，并且D-型肽在含有NaCl、MgCl2和血清的环境中抗菌活性高于L-型[43–44]。

3.3.2 环形CATHs的构建

将多肽的骨架进行环化是一种有效的增强稳定性的手段。一般分为两种，一种是共价键连接 N-端的-NH3和 C-末端的-COOH；另一种是N-端Cys和C-端Cys的-SH形成二硫键。将富含 Arg和 Trp的短肽进行环化，发现其酰胺键环化类似物在酶中的稳定性显著提高[45]。

3.3.3 构建模拟型CATHs

CATHs的抗菌活性与其理化性质及高级结构密切相关，通过模拟其高级结构有望构建在体内体外环境中较为稳定的模拟型CATHs。目前已被成功模拟的二级结构主要有：α-螺旋、β-折叠、β-转角和loop等[46]。其次，采用寡酰基赖氨酰和类固醇-胺共价物低聚体(Oligoacyllysines，OAKs)来模拟CATHs的两亲性和正电荷性，并且寡酰基赖氨酰的疏水性可以通过调控酰基链的长度实现[47]。由此该类化合物既能发挥抗菌性能，同时又具有抗蛋白酶降解、耐酸等优点[48]。

3.3.4 构建固位型CATHs

通过化学或物理方法将CATHs固定在载体上，形成固位型CATHs，可使稳定性显著增强，如固位型LL-37[49]。固位后CATHs的二级结构、间隔区、密度、活性序列、易变性、固定链位置和周围环境都会影响其生物学效价[50]。但研究表明间隔区的长短、固定链的位置及 N端的疏水性残基比表面密度对于抗菌活性而言更加重要。

4 展望

CATHs作为优秀的抗感染抗炎症新药模板，近年来对其进行的分子改造已成为热点，目的均是最大限度地提升其药理学活性，降低毒副作用及解决蛋白类药物所特有的稳定性差的问题。目前围绕CATHs的结构、带正电荷以及疏水性AA的数量及位置，对CATHs进行功能改造，如残基替换、构建杂合肽、截取天然抗菌肽的部分序列以及增加肽链的正电荷含量等手段均取得了较大进展，已有一些优势改造体除药理活性明显提升外，成药性也得到显著加强，已进入临床研究。随着结构生物学的发展，更多CATHs的三维结构可被精确模拟，在此基础上的结构和功能关系以及分子设计将得以更加定性定量的发展。

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(本文责编 陈宏宇)

Relationship between structure and function of cathelicidins and their molecular design: a review

Chen Wang1, Lan Feng1, Haining Yu1, and Yipeng Wang2

1 School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China
2 College of Pharmaceutical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, Jiangsu, China

Cathelicidins play critical roles in mammalian innate immune defense against invasive bacterial infection. Inaddition to their broad-spectrum bactericidal effect, cathelicidins are interesting peptide-based drug templates because they have multiple functions including anti-inflammatory, wound healing, and angiogenesis promotion. This article summarizes the aim and method of cathelicidin molecular designs. Residue mutation, fragment assembly, chemical modification, and construction of conjugates and dimers are usually used to increase the biological activities. Addition or deletion of certain residues, disruption of leucine zipper and phenylalanine zipper are used to reduce the hemolysis and cytotoxicity. By substituting L-amino acids with D-amino acids, circular constructions and immobilization, cathelicidins’ in vitro and in vivo stability could be greatly enhanced, especially their proteinase resistance.

cathelicidins, structure, function, molecular design, stability

Haining Yu. Tel/Fax: 86-411-84708850; E-mail: yuhaining@dlut.edu.cn

10.13345/j.cjb.160247

Received: June 24, 2016; Accepted: September 6, 2016

Supported by: Research Projects of Liaoning Ocean and Fisher Administration (No. 201404). Suzhou Science and Technology Development Project (Nos. SYN201407, SYN201504), Haimen Science and Technology Development Project (No. 2015NY06), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20160336), Natural Science Fundation of College in Jiangsu Province (No. 16KJB35004).

辽宁海洋与渔业厅项目 (No. 201404)，苏州市科技计划应用基础项目 (Nos. SYN201407, SYN201504)，海门市科技计划 (No.

2015NY06) 江苏省自然科学基金 (No. BK20160336)，江苏省高校自然科学基金 (No. 16KJB35004) 资助。

王晨, 冯兰, 于海宁, 等. Cathelicidins结构与功能的关系及其分子设计研究进展. 生物工程学报, 2017, 33(1): 27–35.

Wang C, Feng L, Yu HN, et al. Relationship between structure and function of cathelicidins and their molecular design: a review. Chin J Biotech, 2017, 33(1): 27–35.