精芪双参胶囊对脑缺血再灌注损伤及其作用机制的探讨*

唐晓桐 徐 建 许艳茹 于艳辉 石 菊 邢 成 郑广晶 崔宪利 白 冰

（吉林修正药业新药开发有限公司 长春·130012）

精芪双参胶囊由黄芪、丹参、人参、黄精四味药组成，补气养阴，活血化瘀，养心安神；适用于心脑血管疾病之心悸气短，头晕头痛，倦怠乏力，耳鸣眼花等病症。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡。脑缺血再灌注后神经损伤是一个复杂的超联反应，项目：“双十工程”重大科技成果转化项目（20150301009YY）。吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室。

其损伤机制主要是与细胞内钙超载、自由基损伤、兴奋性氨基酸增加、炎症因子释放及酶类等因素有关[1-2]的复杂的多因素过程。大量文献报道黄精多糖、人参花蕾皂苷、人参Rb组皂苷和黄芪等成分都有保护脑损伤的作用[3-6]。

缺血性脑血管疾病的发病率、致残率和病死率均较高，一般以局灶性脑缺血为主，其中大脑中动脉栓塞造成的脑梗死最为多见，因此精芪双参胶囊在脑缺血疾病的治疗方面有广阔前景。

1　实验动物与器材

1.1动物ICR小鼠，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g；SD大鼠，雌雄各半，体重230-250g；均购自吉林大学基础医学院实验动物中心，动物合格证号：SCXK(吉 )-2014-0003。

1.2药物与试剂精芪双参胶囊：棕色粉末，由吉林长白山药业集团股份有限公司提供，批号：20150829；盐酸氟桂利嗪胶囊，西安杨森制药有限公司，批号：150327791；TTC：货号T8170；甲醛，批号：170305，天津市北联精细化学品开发有限公司；无水乙醇，批号：20151215，北京化工厂；肿瘤坏死因子-α,批号:20170208，南京建成生物工程研究所；白介素-1β：批号：20170208，南京建成生物工程研究所。

1.3仪器MCAO线栓，型号：2634-A4、2636-A4，北京西浓科技有限公司。酶标仪SMP-500-18272-LSI0型：Manufactured in China Designed in California USA ；精密电子天平ESJ60-4：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；离心机LDZ5-2型：北京医用离心机厂。

2　方法

2.1对小鼠脑缺血后存活时间的影响[7]

2.1.1分组及方法ICR小鼠50只，随机分为空白组，盐酸氟桂利嗪组（3mg·kg-1），精芪双参高、中、低剂量组（1800、1080、360mg·kg-1），每组10只，灌胃给药10ml·kg-1，连续7d。末次给药后1h在小鼠耳后2mm处快速断头，使头落到预热至37℃的水浴箱上，然后记录小鼠断头后的呼吸次数及呼吸维持时间(以小鼠张口喘息为判断标准)。

2.1.2检测指标脑组织含水量及脑指数测定：于冷冻冰袋上快速开颅取脑，以-4℃生理盐水洗净血渍用滤纸吸干，用眼科镊子和手术刀片取下嗅球、小脑及低位脑干，留取大脑，将脑分别置于电子天平(万分之一)称湿重。然后将脑放于烘箱中恒温100℃，24h持续烘干，然后称大脑干重，计算脑含水量。（脑含水量=(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%；脑指数=脑湿重/体重×100%）

2.2大鼠脑缺血再灌注实验[8-10]

2.2.1分组及方法 SD大鼠90只，随机分为假手术组，模型对照组，盐酸氟桂利嗪组(2mg·kg-1)，精 芪 双 参 高、 中、 低 剂 量 组（1000、500、250mg·kg-1），每组15只，灌胃给药10ml/kg，连续给药7d，手术前12 h动物术前禁食不禁水，于末次给药后1h，用戊巴比妥钠（45mg·kg-1）麻醉大鼠，将大鼠仰卧位固定，用碘伏润湿颈部毛，用手术剪刀将大鼠颈部正中切口约20-25mm，分离皮下结缔组织。分开颈前肌群，剥离神经，暴露颈总动脉，沿颈总动脉向上剥离可见颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），用手术线将ECA、ECA分支枕动脉、甲状腺上动脉和ECA的终末支远心端结扎，再在近心端并远离劲总动脉的地方结扎，使颈外动脉两个结扎点之间有一定距离。CCA、ICA用动脉夹夹闭，把ECA远心端拉直与ICA成一条直线，用眼科手术剪在ECA上剪一小口。将线栓弯曲向屋顶方向从ECA插入ICA，扎紧分叉处手术线，移去ICA上的动脉夹，进入ICA。缺血2h后，拔出线栓进行再灌注。

2.2.2动物神经行为学评分[11]脑缺血再灌注后将苏醒后的动物放回笼内，使其自由饮食。24h后按z-Longa评分法随机评估并记录神经功能缺损评分：无功能障碍记为0分；不能伸展右侧前肢记为1分；向右侧旋转记为2分；向右侧倾倒记为3分；无自主活动伴意识障碍记为4分；死亡记为5分。分数越高，表示动物神经功能损伤越大。满足1分、2分和3分的动物为造模成功。

2.2.3检测血清中TNF-α、IL-1β大鼠麻醉后腹主动脉取血，2500r·min-1离心10min后分离血清，ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β。

2.2.4测定脑组织匀浆中SOD、MDA和LDH活性 冰盒上取脑组织，用眼科镊子去除嗅球，用生理盐水按脑组织：生理盐水=1:9匀浆，制成10%匀浆液，3000r·min-1离心15min，按照试剂盒说明书，测定SOD、MDA和LDH活性。

2.2.5脑梗死面积 大鼠麻醉后断头取脑，冰生理盐水预处理10min，自前向后切成5片，每片切成2mm厚。0.25%TTC溶液染色，37℃避光孵育30min（每隔10分钟翻动一次），染色完成后用10%甲醛溶液固定，数码相机拍照，用图片处理软件计算脑梗死容积百分比(红色为正常脑组织，白色为脑梗死组织)。

2.3数据统计

3　实验结果

3.1 对小鼠脑缺血后存活时间的影响

阳性对照组可以明显延长小鼠存活时间及断头后的喘息次数，并能降低脑指数及脑含水量的增加，与空白组比较有显著意义（p＜0.05）；精芪双参中剂量组可显著延长小鼠存活时间及断头后的喘息次数，与空白组比较非常显著意义（p＜0.01）；而高剂量组可延长小鼠存活时间及有效抑制脑指数的增长，与空白组比较有显著意义（p＜0.05），结果见表1。

表1　对急性脑缺血小鼠存活时间和喘气次数的影响（±s，n=10）

表1　对急性脑缺血小鼠存活时间和喘气次数的影响（±s，n=10）

注：与空白对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。

组别　　剂量（g·kg-1）　　存活时间（s）　　喘气次数　　脑指数（%）　　脑含水量（%）空白组　　——　17.7±2.37　12.5±1.38　2.05±0.018　77.1±3.66盐酸氟桂利嗪组　3.9　19.8±1.81*　13.9±1.52*　1.93±0.012*　73.3±3.71*高剂量组　1800　18.07±2.60*　13.6±1.63　1.89±0.016*　75.8±1.63中剂量组　1080　21.7±3.38**　14.1±1.30**　1.91±0.019　76.6±1.47低剂量组　360　17.35±3.73　13.0±1.32　2.04±0.014　76.0±0.46

3.2对大鼠脑缺血再灌注的影响

3.2.1对大鼠神经行为学评分差异 模型对照组神经行为学评分较高，说明脑缺血较严重，与假手术组较具有显著意义（p＜0.001），盐酸氟桂利嗪组，高、中剂量组神经行为学评分降低，表明药物发挥一定的保护作用，与模型对照组比较有显著意义（p＜0.05，p＜0.01），结果见表 2。

表2　对大鼠神经功能缺损评分（±s，n=10）

表2　对大鼠神经功能缺损评分（±s，n=10）

注：与假手术组比较＃＃＃p＜0.001，与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。

组别　　剂量(mg·kg-1)　　评分假手术组　　——　0模型对照组　　——　2.1±0.8＃＃＃盐酸氟桂利嗪组　2　1.3±0.5*高剂量组　1000　1.4±0.6**中剂量组　500　1.4±0.5**低剂量组　250　1.7±0.7

3.2.2对血清生化指标的影响 与假手术组比较，模型对照组含量明显增高（p＜0.001）；与模型对照组比较，精芪双参胶囊中、高剂量组及盐酸氟桂利嗪组可明显抑制大鼠炎性因子，降低IL-1β、TNF-α在大鼠血清中含量，与模型对照组比较有意义（p＜0.05，p＜0.01），结果见表 3。

表3　对大鼠血清IL-1β、TNF-α的影响（±s，n=10）

表3　对大鼠血清IL-1β、TNF-α的影响（±s，n=10）

注：与假手术组组比较＃＃＃p＜0.001，与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01。

组别　　剂量 (mg·kg-1） IL-1β（ng·L-1）TNF-α（ng·L-1）假手术组　　——　23.5±15.0　122.4±5.3模型对照组　　——　58.2±12.0＃＃＃ 173.6±10.7＃＃＃盐酸氟桂利嗪组　2　32.6±8.2***　150.4±3.5**高剂量组　1000　37.6±14.3*　163.9±3.7*中剂量组　500　34.3±23.1**　152.7±6.2**低剂量组　250　44.8±26.1　170.8±7.3

3.2.3对脑组织中SOD、MDA和LDH的影响 模型对照组大鼠脑组织LDH和MDA释放增加，SOD活力明显降低，与假手术组比较有显著性差异（p＜0.05，p＜0.001）。精芪双参胶囊中剂量组可明显抑制大鼠脑组织中LDH和MDA含量的释放，盐酸非桂利嗪组，高、中剂量组提高SOD活力变化，与模型对照组比较有意义（p＜0.05，p＜0.01），结果见表 4。

表4　对大鼠脑组织SOD、MDA和LDH的影响（±s，n=10）

表4　对大鼠脑组织SOD、MDA和LDH的影响（±s，n=10）

LDH（U·L-1）假手术组　　——　208.5±20.1　45.0±2.7　1342.3±331.5模型对照组　　——　153.8±28.6＃　67.6±3.5＃＃＃　2496.1±311.3＃＃＃盐酸氟桂利嗪组　2　173.0±23.3*　53.6±3.1**　2296.7±246.5**高剂量组　1000　182.4±19.7*　61.1±4.0　2075.5±359.2中剂量组　500　167.4±25.6*　59.2±3.3**　1535.9±292.4*低剂量组　250　157.6±20.3　63.7±3.7　2084.9±445.4组别　　剂量(mg·kg-1)SOD（U·mgprot-1）MDA（nmol·mgprot-1）

3.2.4大鼠脑梗死面积

模型对照组大鼠脑缺血面积明显增大，盐酸氟桂利嗪组、精芪双参胶囊高、中剂量组可有效缩小脑缺血大鼠脑梗死面积，与模型对照组比较有显著性差异（p＜0.05，p＜0.001），结果见表 5。

表5　对大鼠脑梗死面积的影响（±s，n=10）

表5　对大鼠脑梗死面积的影响（±s，n=10）

注：与假手术组比较＃＃＃p＜0.001，与模型对照组比较*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。

组别　　剂量（mg·kg-1）　　梗死面积百分比（%）假手术组　　——　1.4模型对照组　　——　47.9＃＃＃盐酸氟桂利嗪组　2　14.1***高剂量组　1000　23.8**中剂量组　500　29.5*低剂量组　250　32.9

4　讨论

小鼠急性断头后，脑部血液供应中断，脑能量代谢发生障碍，但脑中原有的血液和营养物质尚能使脑功能维持一段时间，表现为小鼠有规律的喘气，当能量消耗至一定程度，活动终止[7]。本研究显示精芪双参胶囊可明显改善小鼠脑部的供血供氧，从而延长小鼠存活时间及断头后的喘息次数，降低脑指数和脑含水量。

氧自由基学说在脑缺血再灌注损伤机制中占有重要地位[12]。大鼠脑缺血再灌注实验中，精芪双参胶囊通过保护提高超氧化物歧化酶SOD活力，抑制脂质过氧化物MDA的释放降低氧化应激反应进而发挥保护脑组织缺血的作用。大量的文献表明，大鼠脑缺血后会引起TNF-α、IL-1β等炎症因子的大量生成，进而引起脑细胞的炎症反应和细胞凋亡，TNF-α、IL-1β在脑缺血性损伤中起着重要的作用[13-14]。精芪双参胶囊在脑缺血损伤中，抑制了炎症因子TNF-α、IL-1β的生成，进而减少急性脑缺血对大脑的损伤；另外由于缺血损伤造成血脑屏障的破坏，导致细胞周围间隙的液体增加，进一步加重细胞水肿甚至凋亡，引起组织能量供应的缺乏而产生脑组织梗死。精芪双参胶囊能明显地缩小脑组织受损引起的梗死面积。

5　结论

本文通过小鼠急性脑缺血、大鼠脑缺血再灌注模型研究精芪双参胶囊对脑组织保护作用，为精芪双参胶囊的开发利用提供依据。

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