关于体外光化学疗法与器官移植研究进展

杨绍臻，杜国盛（解放军第309 医院全军器官移植研究所肝胆外科，北京 100091）

1 前 言

体外光化学疗法（extracorporeal photopheresis， ECP）是一种细胞治疗方法，由Edelson于1986年第一次提出并且首次应用于皮肤T细胞淋巴瘤，随后广泛应用于T细胞介导的疾病治疗［1］。目前，ECP作为一种新型疗法已广泛应用于包括心、肺在内的多种同种异体移植物抗宿主排斥反应疾病中［2］。ECP的应用前景广阔，被认为是一种新型免疫调节疗法，与抗排异药物相比，它的应用具有不良反应少、安全性高、应用广泛等特点。本文将近年来国内外对ECP在器官移植方面的研究进展进行综述。

2 作用机制

体外光化学疗法由3部分组成：① 从患者浓缩的白细胞中收集单核细胞；② 在8-甲氧基补骨脂素（8-methoxypsoralen， 8-MOP）存在的情况下，用长波紫外线即紫外线A（ultraviolet A， UVA）照射收集的单核细胞；③ 将光照后的细胞重新回输到同一患者体内［3］。

8-MOP属呋喃香豆素类化合物，最早用于治疗白癜风，现与UVA联合应用于ECP治疗。未经UVA照射时，8-MOP作为一种DNA插入分子处于惰性状态。当暴露于UVA （320～400 nm）时，8-MOP被激活并插入两DNA之间与核酸碱基形成共价键。当UVA光照持续存在时，另一个共价键在DNA反向链的胸腺嘧啶核苷与另一侧的8-MOP之间形成，从而产生一种多聚体交联产物并启动凋亡［4］。细胞凋亡或程序性细胞死亡是一个非常复杂的生理过程，研究发现，该反应早期启动的凋亡包括线粒体功能的破坏，抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax比例的反向逆转。迟发凋亡包括CD95、FasL水平升高［5］。通过上述机制加速细胞凋亡。

与淋巴细胞的反应相反，单核细胞似乎对由ECP治疗导致的细胞凋亡有抵抗性。单核细胞被激活并释放细胞激素，如白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）［6］。最近一项研究表明，ECP可以减少被治疗的单核细胞变异成不成熟的DC细胞。同时，不成熟的DC细胞也会失去他们在ECP之后因脂多糖刺激而成熟的能力［7］。研究表明，CD36标志物会在单核细胞表面大量扩增，而且CD36为摄取凋亡物质的主要受体，这也同时说明ECP治疗可以提高细胞清除率［8］。

Daniele等［9］对13例被诊断为慢性移植物抗宿主病的患者应用ECP治疗，通过流式分析仪对其血液样本进行分析，证实了ECP治疗可使光敏化的单个核细胞的坏死及凋亡率显著升高。回输后的凋亡细胞将被抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）吞噬，后者被激活并在其表面表达抗原，随后产生抗炎因子IL-10，并促进调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）的产生［10-11］。在 ECP治疗中进一步的免疫变化为 CD81［12］和 Th17［11］细胞数量减少，可溶性的IL-2-Ra和TNF-a R1水平减少［13］，分泌γ-干扰素（interferon-γ，IFN-γ）的Th1细胞会减少80%以上；另一方面分泌 IL-4、IL-5、 IL-10的 Th2细胞增多［14］。这一系列变化可导致Th1/Th2水平的恢复和CD4/CD8比值的正常化［15］。通过上述机制会降低移植术后排斥反应的发生率。

3 ECP在临床医学中的应用

3.1 肺移植：肺移植是一种针对终末期呼吸衰竭患者的有效治疗方法［16］，并且在近15年的时间内显著提高了呼吸衰竭患者的生存率。慢性同种移植物功能紊乱也被称作闭塞性细支气管炎综合征（bronchiolitis obliterans syndrom，BOS），它是威胁接受肺移植患者长期生存和生活质量的主要因素。1995，年Andreu等［17］第一次创造性的将ECP治疗应用于肺移植后急性排斥反应（acute rejection，AR）与严重感染的治疗，3周后患者的临床症状得到改善。

Jaksch等［18］随访了1989-2010年1 012例肺移植患者，其中194例患者平均（1 293±1 008）天发展为BOS，51例患者接受了ECP治疗，研究发现，接受ECP治疗的患者中有31例患者通过ECP治疗，在超过6个月的时间内表现出持续稳定的肺功能。与未经ECP治疗的患者相比，接受ECP治疗的患者生存率提高且再移植发生率低（P=0.001）。此项研究证实了早期应用ECP对于肺移植后患有BOS的患者是一项有效的辅助治疗。

Greer等［19］于2013年回顾性分析了自2007年10月1日- 2011年9月1日通过ECP治疗慢性移植后肺功能障碍（chronic lung allograft dysfunction，CLAD）的患者，其中65例被纳入此项研究，此外，64例在接受阿奇霉素治疗的情况下病情仍持续恶化。经回顾性研究发现，其中8例患者的第1秒用力呼气容积（forced expiratory volumn one second，FEV1）提高≥10%，27例患者FEV1处于稳定状态，30例患者FEV1下降≥10%，且经过ECP治疗的患者生存率较未经ECP治疗的患者明显提高（401天比133天）。此研究证实了ECP治疗可作为一种有效的二线治疗方法，广泛应用于CLAD患者治疗中。

Brownback等［20］通过统计患者FEV1值来评价ECP对肺部移植物抗宿主排斥反应的治疗效果。此项研究共纳入8例患者，且8例患者均为肺移植后新发气道阻滞疾病且接受糖皮质激素治疗后FEV1值仍持续下降。8例患者接受ECP治疗并记录1年FEV1值的变化情况。在ECP治疗的最初3个月，其中7例患者FEV1未继续下降。然而1年后，只有2例患者FEV1值稳定在正常范围内。尽管通过1年的ECP治疗，患者FEV1的平均值仍会继续下降，但与未接受ECP治疗的患者相比，接受ECP治疗后FEV1下降率会大幅度减小。经过1年ECP治疗，所有8例患者全部存活且期间内泼尼松的平均用药量明显减少。此研究表明，ECP能明显降低肺移植患者FEV1的下降率。

3.2 心脏移植：心脏移植是治疗各种原因导致的心脏疾病的有效方法［21］。根据最新国际心肺移植协会数据统计显示，在2011年已经有超过4 000例心脏移植［22］。有超过25%接受心脏移植的患者会在1年内出现AR，其中约有5%的患者会出现血流动力学损害［23］。1992年第一次报道了ECP疗法应用于心脏移植患者治疗，此项报道也最早阐述了接受2 ～ 4次ECP治疗后，通过快速活组织检查可发现AR发生了逆转［24］。

1998年，Barr等［25］在多个研究中心开展了一项前瞻性随机临床试验。在此次研究中，60例心脏移植患者在移植后随机接受三联免疫抑制治疗，或是三联免疫抑制治疗并在移植30小时内进行ECP治疗。随访6个月显示，ECP（第1个月接受10次治疗，第2个月和第3个月接受4次治疗，第4 ～ 6个月接受2次治疗）会明显减少心脏排斥的发生率（P=0.03）。第一次出现排斥发作的时间并无明显差别，排斥反应的发生率与血流动力学异常或6个月、12个月的生存率有关。而用PCR检测血浆中巨细胞病毒DNA含量，发现其含量值在ECP治疗组有明显降低（P=0.036）。这项研究表明，ECP治疗并不会促进免疫移植患者感染的发生，反而起到抑制作用。

2006年，Kirklin等［26］的回顾性研究对13年来的心脏移植排斥经验进行了总结。研究包括36例患者有血流动力学异常（hemodynamic compromise，HC）或顽固性排斥反应，接受了至少3个月的ECP治疗，307例未接受ECP治疗。通过对生存率及危险因素进行分析发现，经过3个月的ECP治疗，排斥反应发生率降低（P=0.04），而且随后的排斥反应危害也显著降低。这是第一个证实ECP治疗可减少有高排斥风险患者死亡风险的研究。

2009年，Zheng 等［27］探究了DC细胞吞噬经体外光化学疗法（psoralen combined with A-band ultraviolet，PUVA）处理的脾淋巴细胞（sp）后对心脏移植大鼠外周血Treg细胞及移植后大鼠存活率的影响。此实验以DA大鼠为供体，Lewis大鼠为受体。取DA大鼠脾细胞通过PUVA处理后与受者DC细胞进行共培养，获得PUVA-SPDC。分别建立：① 对照组（n=7）：注射PBS；② SPDC组（n=8）：注射受者SP与受者DC共培养细胞；③ PUVA-SPDC组：注射PUVA-SP细胞与DC共培养细胞（n=8）。研究发现，PUVA-SPDC组外周血Treg细胞占CD4+T的比例为（29.00±1.73）%，明显高于对照组的 （12.00±0.58） %和SPDC组（16.30±0.88）%。流式细胞学检测分析表明，SPDC组表面分子CD80、CD86以及OX6的表达分 别 为（16.60±0.72）%、（36.50±0. 87）% 及（65.60±1.45）%明显高于PUVA-SPDC组CD80、CD86以及OX6的表达分别为（3.90±0.12）%、（13.40±0.59）%及（28.00±1.73）%，该结果表明PUVA-SPDC可提呈供者抗原的imDC细胞。由此推论，PUVA-SPDC可以诱导移植物受者对供者抗原特异性负向免疫调节。

在另一项研究调查中，有7例心脏移植患者接受了超过6个月的ECP治疗。其中6例患者患有慢性左心室功能不全，经ECP治疗后心功能得到明显改善，1例患者发生复发性抗体介导的排斥反应（antibody mediated rejection，AMR），经ECP治疗后未再次发生［28］。此外， 群体反应性抗体（panel reactive antibody，PRA）的平均峰值由（83±17）%降至（38±42）%（P=0.022），经ECP治疗后炎性细胞因子同时也显著下降。

3.3 肾移植：2011年，Kusztal等［29］将 ECP治疗与常规的免疫抑制剂治疗联合应用，作为一种预防性的治疗手段，并将此方法应用于10例肾移植术后患者，通过与单纯应用免疫抑制剂治疗的10例肾移植术后患者对比做出一项验证性研究。ECP治疗组在2.5个月接受12 ～ 16次治疗，ECP治疗组与对照组均定期复查肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR），定期记录外周血 T细胞、B细胞、树突状细胞、Treg细胞、NK细胞等计数值。研究发现，与对照组相比，ECP治疗组在第3个月（53±11比47.1±9.0； P=0.17）和第6个月（67.5±10.0比53.6±3.0； P=0.03）GFR值显著升高。Treg细胞（CD3+CD4+CD25+）占总CD3细胞数的比值在接受3个月ECP治疗后显著升高。与对照组相比，ECP治疗组患者外周血Treg比例明显升高〔（9.4±15.0）% 比（3±1）%，P=0.01）〕。虽然该研究患者病例数少，研究随访时间短，但可得出初步结论：ECP可作为早期辅助治疗来减少肾移植排异反应发生率。

3.4 肝移植：Urbani等［30］评估了钙调磷酸酶抑制剂（calcineurin inhibitor，CNI）与不同种免疫抑制剂联应用后神经性肾毒性并发症的发生率。从2006年1月-10月，对所有肾脏或神经学并发症的肝移植受者进行了ECP+吗替麦考酚酯+类固醇以及CNI治疗，并将其与使用标准的CNI治疗的对照组进行对比。ECP组包含24例患者，他们的终末期肝病的平均评分为（19.9±11.1）分。对照组包含18例患者，平均评分为（12.5±5.2）分 （P=0.012），对于ECP组，肝移植后开始应用CNI的平均水平为（9.2±6.2）天 （4～31天）。在第一次CNI治疗后，ECP组中5例患者分别在移植后第4、5、6、6、14天出现急性神经性中毒性肾损害。ECP组患者在第1、6、12个月的生存率分别为100%、95.8%、95.8%，对照组患者的生存率分别为94.4%、77.7%、72.2% （P＜0.001）。总之，ECP治疗对于控制CNI引起的病症有效，并且可降低早期移植术后阶段的病死率。

4 总结与展望

已有大量研究证实ECP作为一种辅助治疗，应用于移植术后患者，可抗排异反应发生从而降低患者病死率。然而关于ECP治疗仍存在很多问题，如ECP治疗的最佳应用时间、停用时间、如何监控治疗情况以及是否可以替代药物治疗等，也未有相关研究指出患者应用ECP治疗的适应证。此外，长期应用ECP治疗对患者是否有害。针对上述问题，各研究机构仍未得到一致的答案。因此，尽管ECP治疗已取得令人鼓舞的临床治疗效果，但其有关作用机制还未明确，还需大量研究，从而制定出更完善的治疗方案。