探讨RhD阴性表型中个体D基因多态性研究

陈 俊， 马雨东

(江苏省南通大学附属医院输血科， 江苏 南通 226000)

探讨RhD阴性表型中个体D基因多态性研究

陈 俊， 马雨东

(江苏省南通大学附属医院输血科， 江苏 南通 226000)

目的：探讨RhD阴性表型中个体D基因的多态性。方法：随机抽取2014年11月至2015年10月采集的135例无亲缘关系的RhD阴性血液样本作为研究对象。采用抗人球蛋白试验(又称Coombs试验)来检测RhD阴性表型个体，并运用序列特异引物引导的PCR反应(简称PCR-SSP方法)对RhD阴性表型中个体基因结构特点进行分析与统计。结果：135例经Coombs试验检测为阴性表型个体中，检测结果显示为外显子完全缺失有75例，占比55.56%(75/135)，外显子部分缺失29例，占比21.48%(29/135)，外显子完整31例，占比22.96%(31/135)；采用PCR-SSP法进行基因分型，RHD基因完整中RhD(1227A)占比16.30%(22/135)，弱D15型占比0.74%(1/135)，RHD阳性占比5.19%(7/135)；检测RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D占比5.93%(8/135)，DVa(Has)占比0.741%(1/135)，DVIⅢ占比0.74%(1/135)。结论：我国RhD阴性人群的RhD基因基础结构呈现多态性特征，且不同地区的人群有着相同的Rh血型遗背景，今后可以尝试采用血清学与基因分型联合方法检测RhD阴性中的D抗原。

RhD阴性； 个体D基因； 多态性

Rh血型包括54种抗原抗体系统，而与临床医疗有密切联系的有5种，它们是。相对于其他4种抗原，D抗原具有较强的免疫原性，因此D抗原是临床上最重要的抗原体。目前，有许多国内外研究表明，具有种族差异的血液在Coombs试验中检测为RhD阴性表型个体中仍发现RhD基因，表明RhD阴性个体因种族不同而有所差异，同时具有基因多态性特征[1]。如果人体血液红细胞中包含Rh凝集原，则是Rh阳性血，不包含Rh凝集原，则是Rh阴性血。这使得红细胞A、B、O和AB四种血型又分别被一分为二地划分为Rh阳性血与Rh阴性血。随着对Rh血型的研究不断深入，发现Rh血型是人体红细胞血型中最复杂的一个血型系统。据有关研究表明，99.7%的中国汉族及大部分少数民族人血液属于Rh阳性血[2]。在我国，仅有3‰～4‰的人群血液属于RH阴性血型。因此RH阴性血型被称为“熊猫血”，是一种非常罕见的血型。Rh阴性血型的发现，有利于医学上更加科学地开展输血工作。现随机抽取2014年11月至2015年10月我血站中心采集的135例无亲缘关系的RhD阴性血液样本作为研究对象，探讨RhD阴性表型中个体D基因的多态性。具体研究报道如下。

1 资料与方法

1.1 血样资料:随机抽取2014年11月至2015年10月我血站中心采集的135例无亲缘关系的RhD阴性血液样本作为研究对象，血液样本10mL/份，献血自愿者中女55例，男80例，志愿者年龄19～51岁，平均年龄(35±1.06)岁。

1.2 方 法

1.2.1 血清学方法:对135例RhD阴性血液样本进行Coombs试验。采用混合抗试剂对RhD阴性血液样本进行筛选，采用三种不同厂家提供的抗血清试剂与样本抗血清作对比，通过Coombs试验、乙醚放散试验将部分D、Del及弱D等样本剔除，从而检测出真正的RhD血液样本。

1.2.2 DNA制备:运用DNA电泳检测法来制备血样基因组的DNA。先完成1%浓度的琼脂糖凝胶板的制备，再进行基因组的DNA电泳实验，接着使用琼脂糖凝胶电泳分离DNA，然后采用基因组的DNA提取试剂盒(由北京宜科思源科技有限公司提供，货号：D3471-00)从所选的RhD血样标本中制备基因组的DNA，操作步骤严格按照试剂盒的说明书来进行。

1.2.3 PCR-SSP法基因分型:采用RhD基因检测试剂盒(由北京宜科思源科技有限公司提供，货号：D4352-08)对RhD阴性表型中个体基因结构特点进行检测与分析，检测RhD阴性等位基因的构成。PCR产物经电泳分离，银染后呈现出不同的阶梯状扩增片段图谱。采用凝胶成像仪观察PCR产物的图谱特征。

1.3 评定标准:采用Coombs试验检测并统计RhD阴性个体中外显子完全缺失、外显子部分缺失以及外显子完整的例数；采用PCR-SSP法检测并统计RhD阴性个体中外显子部分缺失与外显子完整的等位基因的分布种类。

2 结 果

2.1 RhD阴性表型个体表现:135例RhD阴性血液样本经Coombs试验确认为RhD阴性个体中检测结果显示为外显子完全缺失75例，占总数比例55.56%(75/135)，外显子部分缺29例，占总数比例21.48%(29/135)，外显子完整,31例，占总数比例22.96%(31/135)。具体如表1所示。

表1 RhD阴性表型个体情况

2.2 RhD阴性等位基因构成情况:采用PCR-SSP法进行基因分型，检测结果显示RHD基因完整中RhD(1227A)22例，占总数比例16.30%(22/135)，弱D15型1例，占总数比例0.74%(1/135)，RHD阳性7例，占总数比例5.19%；检测RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D8例，占总数比例5.93%(8/135)，DVa(Has)1例，占总数比例0.741%(1/135)，DVIⅢ1例，占总数比例0.74%(1/135)。具体如表2所示。

表2 RhD阴性等位基因构成情况

3 讨 论

最早的研究提示， RhD阴性个体中缺失RHD基因，而RhD阳性个体中存在RHD基因[3]。但随着检测技术的进步与研究理论的发展，有学者研究发现，RhD阴性可能包含多种等位基因，其具有多态性特点，并因种族差异而呈现不同的遗传背景。以高加索人为代表的大部分欧美人种，其RhD阴性个体均表现为RHD基因完全缺失。有学者对RhD阴性表型为的3名澳大利人进行研究，发现存在三种情况，其中1名完全缺失RHD基因，1名部分缺失RHD基因，另1名有着完整的RHD基因[4]。另有学者对非洲人种的Rh血型进行研究发现，其中部分非洲人中存在RHD假基因，包含RHD假基因的阴性个体会执行对密码子的抑制，从而致使RHD基无法完成转变。此外还在部分非洲人种的RhD阴性中发现RHD-CE-D等位基因，这属于杂交基因。据国外研究报道，除了在非洲黑人种的RhD阴性中发现RHD-CE-D杂交位基因外，在对巴西RhD阴性个体进行相关研究时，同样在巴西RhD阴性个体中发现RHD假基因与RHD-CE-D杂交位基因，此外，还有部分巴西RhD阴性个体是RHD基因完全缺失的[5]。从以上国外研究报道可以发现，RhD阴性基因具有多态性特点，并因种族差异而呈现不同的遗传背景。

通过本研究发现，135例RhD阴性血液样本经Coombs试验确认为RhD阴性表型个体中，显示完全缺失D基因75例，占总数比例55.56%，显示部分缺失D基因29例，占总数比例21.48%，显示D基因完整31例，占总数比例22.96%，这与我国福建、广东等地的RhD阴性血型研究报道结果相似。RHD基因完整中RhD(1227A)22例，占总数比例16.30%(22/135)，弱D15型1例，占总数比例0.74%(1/135)，RHD阳性7例，占总数比例5.19%；检测RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D8例，占总数比例5.93%(8/135)，DVa(Has)1例，占总数比例0.741%(1/135)，DVIⅢ1例，占总数比例0.74%(1/135)。有研究表明，我国人群中约有97%的RHD基因表现为RhD(1227A)突变，这有助于通过PCR-SSP法检测RHD基的突变位置，所以PCR-SSP法基因分型将会成为今后检测RhD(1227A)基因的重要手段。除了发现RhD(1227A)基因外，还发现了RHD阳性、弱D15型、DVa(Has)、DVI、RHD-CE(2-9)-D8等多种形态的基因结构。这与我国其他地区的有关报道较接近，说明我国不同地区的人群有着相同的Rh血型遗背景。实验过程中有12例血液样本暂时不能确定RhD阴性的基因结构，目前尚未明确具体原因，不过会在今后的工作中通过改善实验操作或更换试剂盒重新进行检测。

据有关研究报道，在对RhD阴性个体进行检测时发现RhD基因，但这些RhD基因包含D基因却不表现出D抗原特征[6]。现推测出现这种现象的原因主要有两个，其一是RhD阴性个体不是真正的RhD阴性，可能只是D抗原处于较弱势态，由于受到乙醚放散试验的限制而未能检测出其真实的基因结构。本实验也发现了7例RhD阴性个体显示为RHD阳性的基因；其二可能是RHD基因发生核苷酸片段变更、缺失或增加而出现突变现象[7]。我国RhD阴性人群的基因结构呈现多态性特征，与欧美地区白种人的RhD阴性基因结构有着明显的区别，说明用于检测白种人RhD阴机制的基因定型试剂盒并不完全适用于中国人。若今后在采用PCR-SSP法基因分型检测RhD阴性个体时出现不能确定的情况，则须通过确定RHD基因的排列顺序来进一步确认是否存在弱D型、部分D型结构。RhD阴性血液发生输血安全问题的主要原因是抗D基因具有较强的免疫原性。当RhD阴性血液接触到Rh阳性血液时，会有部分RhD阴性个体对D抗原发生致敏反应，等到再次接触到D抗原时就会出现溶血反应。如果RhD阴性孕妇之前有过输血史或生育史，在妊娠时容易出现新生儿溶血，是因为母体是RhD阴性血，而胎儿是Rh阳性血，两者血型不匹配，Rh血型D抗原则会引发新生儿溶血症。鉴于临床输血关系到受血者的生命安全，因此临床医学上应对我国人群的RHD基因基础结构进行更加深入的研究，从而建立起适合我国人群的基因分型架构。

[1] 闫芳,王全立.RhD阴性个体遗传多态性与抗-D同种免疫关系研究[J].北京医学,2014,4:314～316.

[2] 高勇,孟宪军,胡金萍,等.徐州地区汉族RhD阴性人群RHD基因多态性研究[J].国际检验医学杂志,2014,12:1571～1572.

[3] 余加宏,王成辉,张秀慧,等.蚌埠地区124例RhD阴性献血者的RHCE表型及DEL型的分布与基因研究[J].中华全科医学,2014,8:1306～1308.

[4] 杨波,吕运来,兰炯采.洛阳地区回族人群RHD基因Rhesusboxes研究[J].中国输血杂志,2014,9:904～906.

[5] 聂咏梅,周豪杰,李晓帆.RhDel表型与RHEC表型的相关性研究[J].热带医学杂志,2013,2:175～177.

[6] 王志红,肖鲲,任诚诚,吴文静.洛阳地区无偿献血者Rh血型临床相关高频抗原分布调查[J].临床血液学杂志(输血与检验版),2013,4:553～556.

[7] 舒群峰.十堰市Rh弱D和/或部分D变异型血型血清学检测结果分析[J].检验医学,2015,10:1004～1007.

国家自然科学基金，(编号：81141056)

1006-6233(2017)02-0284-03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.033