叶片接种方式和暗培养时间对青砧1号不定芽再生的影响

葛红娟，兰岚，马荣群，沙广利，郝玉金

(1.青岛市农业科学研究院，山东青岛 266000；2.山东农业大学；3.青岛市农业广播电视学校)

叶片接种方式和暗培养时间对青砧1号不定芽再生的影响

葛红娟1,2，兰岚3，马荣群1，沙广利1，郝玉金2*

(1.青岛市农业科学研究院，山东青岛 266000；2.山东农业大学；3.青岛市农业广播电视学校)

以青砧1号组培苗为试材，探讨叶片的接种方式和暗培养时间对叶片不定芽再生的影响。结果表明，以叶背面接触培养基且暗培养3天的叶片不定芽再生数最多，叶片最优。

青砧1号；叶片接种方式；暗培养；不定芽再生

苹果(Maluspumila)矮化密植是现代苹果生产发展的趋势[1]。选用适宜的矮化砧木是实现矮化密植的主要途径之一。国内应用的矮化砧木有GM256、SH6、M9、M26等，多用作于中间砧[2]，这与国外主要推广的自根砧方式[3]相比存在成活率低、个体差异大、整齐度偏低等问题。

青砧1号是从平邑甜茶与柱形苹果株系杂交后代中选育成的无融合生殖苹果砧木，具有结果早、抗逆性强，与多个主栽品种的嫁接亲和能力强[4,5]等优点，能通过种子繁殖，根系发达，整齐度达85%以上，是适宜推广的良好的苹果砧木。

青砧1号也存在一些不足，如易发白粉病等。采用转基因技术是现阶段改良性状的主要途径之一。周瑞金等[6]通过微嫁接技术，验证了苹果外源nptⅡ基因只在转化植株体内表达，不通过嫁接在接穗和砧木间进行传导。李永红[7]成功转化苹果砧木M26，并提高其抗盐性。李海云[8]优化了 GM256和M9的遗传转化体系。吴瑞刚等[9]建立了青砧1号的高效离体再生体系，但就叶片的接种方式和光照条件的优化未见讨论。笔者参考吴瑞刚等[9]报道的最优再生培养基配方，研究青砧1号组培苗叶片的不同接种方式和暗培养时间对叶片不定芽再生的影响，进一步优化高效再生体系，为转基因技术的应用打好前期基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

2015年4月中旬，于晴朗天气剪取青岛市农业科学研究院北宅基地向阳、健壮、无病害的青砧1号植株的新梢，立即置于冰盒带回实验室，进行表面清洗，酒精和升汞复合消毒，无菌水清洗3次。将消毒新梢茎尖置于初代培养基MS +6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.01 mg/L上培养。选择初代培养的无污染、生长状态旺盛的植株继续扩繁，继代培养基与初代培养基配方一致。每20天继代1次，多次继代后，获得足够的试验植株。

1.2 试验方法

取生长一致的青砧1号组培苗茎尖，统一转接至同一批次继代培养基中。20天后，取完全展开、颜色深绿的叶片，沿主脉垂直方向划伤叶片准备接种(划3道，不断开)。接种方式设置为叶片正面接触培养基和叶片背面接触培养基，每培养基各4片，分两行整齐排列于同一瓶中；暗培养时间设为0天、3天、7天、14天，每个时间点处理3瓶，取出后置于16小时光照、8小时暗培养周期下培养，20天后观察叶片不定芽的再生情况，统计再生不定芽数和生长情况。

2 结果与分析

如图1，青砧1号叶片不定芽的再生数，以叶片背面接触培养基的高于以叶片正面接触培养基的。不同暗培养时间对青砧1号的叶片不定芽再生有影响。随着暗培养时间的延长，两种接种方式的叶片不定芽再生数均呈先增加再减少的趋势。暗培养时间为0天时，两种接种方式的叶片不定芽再生数均为0；暗培养时间为3天时，两种接种方式的叶片不定芽再生数均最多，叶片背面接触培养基的可达到12个以上；暗培养时间为7天时，叶片不定芽再生数少于暗培养3天的；暗培养14天时，两种接种方式的叶片不定芽再生数更少，叶片正面接触培养基的不定芽再生数为0，叶片背面接触培养基的几乎为0。

图1 接种方式和暗培养时间对青砧1号叶片不定芽再生的影响

图2为青砧1号组培苗叶片不同接种方式和暗培养时间的叶片不定芽再生的情况。叶片正面接触培养基脱分化形成愈伤组织比叶片背面接触培养基的时间早；但后期分化阶段生长较为缓慢。同时，随着暗培养时间的延长，叶片的颜色逐渐减淡，愈伤组织颜色由深红变为乳白色。

图2 组接种方式和暗培养时间对青砧1号叶片不定芽再生的影响

3 小结与讨论

青砧1号组培苗叶片接种于培养基诱导不定芽再生，叶片不同的接种方式和暗培养时间对叶片不定芽的再生均有影响。叶片不定芽再生数，以叶片背面接触培养基时高于叶片正面接触培养基时；暗培养有助于愈伤组织的诱导[14]，在光照培养条件下愈伤组织才出现不定芽。适合青砧1号的叶片不定芽再生的最佳接种方式为叶片背面接触培养基，暗培养3天时叶片不定芽再生数最多。这与魏国芹等[12]的暗培养14天最佳的结果稍有不同。

在不同接种方式的试验中发现，当叶片正面接触培养基时，叶片在划伤处能够较早的出现愈伤组织，并多出现在叶片最宽处。这可能与叶片能够较为平整并较大面积接触培养基有关。此结果与李艳红等[13]报道的苹果砧木M26 愈伤组织发生时间以叶背面朝上放置略早于叶正面朝上放置的研究结果一致。当叶片正面接触培养基时，叶柄和叶尖处远离培养基，仅叶片的中间一点与培养基接触并参与激素的运输，这可能是其愈伤组织后期分化缓慢的主要原因；而叶片背面接触培养基时，叶片中间部位翘起，形成拱桥状，叶柄和叶尖接触培养基，叶片的叶柄处是最早出现愈伤组织的部位，叶柄处内含大量的维管组织参与激素和营养成分的运输，使得愈伤组织能够快速分化成不定芽。以上可能是叶片背面接触培养基的再生数远大于叶片正面接触培养基的主要原因。

不同材料对叶片接种方式和暗培养时间的反应有所不同。张瑞越等[10]认为，丽格海棠叶片诱导分化培养时，叶片反放的接种方式优于叶片正放。师校欣等[11]对甜樱桃砧木叶片接种方式的再生情况发现：叶片背面接触培养基的培养方式为优。魏国芹等[12]对平邑甜茶和M7叶片的接种方式和暗培养时间与再生的关系研究结果表明，适合二者叶片不定芽再生的最佳暗培养时间14天，平邑甜茶叶片背面接触培养基再生效果好，叶片接种方式对M7叶片不定芽再生无显著影响。

[1] 韩振海.苹果矮化密植栽培-理论与实践[M] 北京:科学出版社,2011.

[2] 刘国荣,陈海江,徐继忠,等.矮化中间砧对红富士苹果果实品质的影响[J].河北农业大学学报,2007,30(4): 24-26.

[3] 原永兵, 刘成连, 马德功,等.欧洲苹果矮化自根砧苗木繁育技术[J].烟台果树, 2010 (2): 30-31.

[4] 沙广利.苹果无融合生殖矮化种质创新[D].山东农业大学, 2007.

[5] 沙广利.无融合生殖苹果砧木新类型-青砧1、2号[J]. 烟台果树, 2015(4): 21-22.

[6] 周瑞金,杜国强,师校欣.标记基因nptⅡ在转基因苹果嫁接砧穗间无相互传导[J].园艺学报,2006, 33(6):1329-1330.

[7] 李永红.农杆菌介导MdNHX1基因转化苹果砧木M.26的研究[D].西北农林科技大学, 2010.

[8] 李海云.苹果砧木遗传转化体系优化与rolB基因遗传转化研究[D].吉林农业大学, 2005.

[9] 吴瑞刚, 杨洪强,沙广利,等.苹果砧木'青砧一号'离体高效再生体系的建立[J].植物生理学报,2013(10): 1053-1056.

[10] 张瑞越, 季勤,李燕.培养及接种方式对丽格海棠组培快繁的影响[J].淮阴师范学院学报:自然科学版, 2009, 8(3):246-249.

[11] 师校欣,杜国强,马宝煙,等.甜樱桃砧木离体叶片愈伤组织诱导及不定芽再生[J].果树学报,2006, 23(4):538-541.

[12] 魏国芹, 梁美霞, 李鼎立,等.平邑甜茶与M7离体叶片不定芽再生的研究[J].青岛农业大学学报:自然科 学版, 2009, 26(2):103-108.

[13] 李艳红, 冯宝焜.苹果砧木M26离体叶片愈伤组织发生及分类研究[J].果树科学,1999,16(4) :259-262.

[14] 崔美,焦其庆, 陈学森, 等.苹果叶片愈伤组织的诱导培养[J].山东农业科学, 2012, 44(3) : 17-20.

2016-06-28

山东省现代农业产业技术体系创新团队岗位专家项目(SDAIT-06-03)

葛红娟(1985-)，女，山东聊城人，助理研究员，果树资源育种及分子生物学研究。E-mail:ghj042@163.com

S661.1

A

1002-2910(2017)02-0008-03

*通讯作者：郝玉金(1971-)，男，山东章丘人，教授，从事果树分子生物学与生物技术研究。