LINGO-1对脊髓神经干细胞增殖及凋亡的作用

赵晨光，许 刚，琚 芬，孙 玮，袁 华，牟 翔*

(1第四军医大学第一附属医院康复医学科,西安 710032;2新疆军区总医院全军骨科中心;*通讯作者,E-mail:Pro.mu@fmmu.edu.cn)

LINGO-1对脊髓神经干细胞增殖及凋亡的作用

赵晨光1，许 刚2，琚 芬1，孙 玮1，袁 华1，牟 翔1*

(1第四军医大学第一附属医院康复医学科,西安 710032;2新疆军区总医院全军骨科中心;*通讯作者,E-mail:Pro.mu@fmmu.edu.cn)

目的 观察LINGO-1对脊髓神经干细胞(spinal cord derived neural stem cells,SNSCs)增殖及凋亡作用。 方法 体外培养大鼠脊髓来源神经干细胞并分为对照组及干扰组,干扰组通过LINGO-1 shRNA慢病毒感染SNSCs下调LINGO-1表达,对照组表达空白载体,采用BrdU及TUNEL染色检测下调LINGO-1表达对SNSCs增殖及凋亡的影响。 结果 下调LINGO-1表达后,干扰组克隆球直径达到对照组克隆球直径的1.18倍,其差异具有统计学意义(P<0.05)。LINGO-1干扰组及对照组BrdU阳性细胞率分别为8.5%及3.8%,而TUNEL阳性细胞率分别为8.4%及11.2%,以上结果比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。 结论 下调LINGO-1表达可以促进脊髓神经干细胞增殖并且抑制细胞凋亡。

LINGO-1； 脊髓神经干细胞； 脊髓损伤； 细胞增殖； 细胞凋亡

脊髓神经干细胞(spinal cord derived neural stem cells,SNSCs)的发现为脊髓损伤后神经修复与功能重建带来一线希望,但是因为生物体内环境复杂及损伤后髓鞘源性抑制因子(myelin-associated inhibitory factors,MAIFs)的释放,使得修复过程困难重重[1]。MAIFs的主要结合受体是NgR,但因此受体缺少胞内段,所以由LINGO-1(LRR and Ig domain containing,Nogo receptor interacting protein-1)及NgR、P75/Troy组成的共同复合受体便在MAIFs介导的多种生理作用中扮演了重要的角色。LINGO-1是由614个氨基酸构成的跨膜生物蛋白,定位于15q24.3。研究表明,LINGO-1可以通过NgR1/P75/LINGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1调节调控轴突延伸和再生、调控神经元存活以及调控少突胶质细胞成熟及再髓鞘化[2,3]。本研究旨在观察LINGO-1基因对脊髓源性神经干细胞增殖及凋亡的作用,为进一步调控其促进脊髓损伤后神经修复带来新思路。

1 材料和方法

1.1 细胞株及实验动物

实验用10周龄雌性Fischer344大鼠(160-180 g)由第四军医大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂与仪器

细胞培养用DMEM/F12、B27添加剂、N2添加剂、GlutaMAX添加剂及胎牛血清等均为Gibco公司(美国)产品;bFGF和EGF购于Peprotech公司(美国),Accutase、Poly-L-Lysine及Laminin购于Sigma公司(美国);Nestin、β-TubulinIII、GFAP、O4一抗购于STEMCELL公司(美国);荧光二抗FITC-conjugated Goat anti-mouse,FITC-conjugated Goat anti-rabbit及Texas Red-conjugated Goat anti-mouse IgG购自STEMCELL公司(美国);BrdU购自Sigma公司(美国),TUNEL试剂盒购于Promega公司(美国)。

1.3 大鼠SNSCs的分离培养

10周龄Fischer344大鼠脊柱脱臼法处死,椎板减压暴露脊髓,取C3至T12节段脊髓置于预冷的Hanks液中,小心用眼科剪剥离硬脊膜,将脊髓剪碎后加入Accutase中于37 ℃中消化30 min,加入NSCs培养基终止消化,离心后用NSCs培养基重悬,用火焰抛光的巴斯德吸管反复吹打成单细胞悬液,用40 μm滤网过滤,胎盘蓝计数,按105/ml接种于NSCs培养基(DMEM/F12+2% B27+1% N2+20 ng/ml EGF+20 ng/ml bFGF)中,每3 d更换半量培养基1次。生长至第7天时机械吹打法传代。每7 d传代1次,传代大于3代进行实验。

1.4 LINGO-1 shRNA慢病毒表达载体构建及包装

由上海吉凯生物基因公司提供。shRNA插入序列为:Sense 5′-TGCTGTAGTCTAGCAGGAT GACGATCGTTTTGGCCACTGACTGACGATCGTCACTGCTAGACTA-3′,Antisense 5′-CCTGTAGTC TAGCAGTGACGATCGTCAGTCAGTGGCCAAAACGATCGTCATCCGTCTAGACTAC-3′。

1.5 脊髓源性神经干细胞增殖实验

待慢病毒感染SNSCs 72 h转入多聚赖氨酸和Laminin包被的玻片上,贴壁培养24 h向培养液中加入BrdU,共孵育24 h,免疫荧光染色。荧光镜计数阳性细胞及总细胞数,获得BrdU阳性率(细胞数/总细胞数)。

1.6 脊髓源性神经干细胞凋亡检测

待慢病毒感染SNSCs 72 h,将SNSCs转入多聚赖氨酸和Laminin包被的玻片上,贴壁培养24 h按照In Situ Cell Death Detection Kit(Promega)说明书标记凋亡细胞。

1.7 免疫荧光染色

吸弃培养基用PBS清洗1次以彻底去除残留的培养基,4%多聚甲醛固定30 min,用PBS清洗3次,每次5 min;加入0.3%Triton X-100通透5 min,PBS清洗2次。加入稀释好的一抗4 ℃孵育过夜,吸弃一抗,PBS洗3次,每次5 min。加入稀释好的荧光二抗37 ℃避光孵育2 h,PBS洗3次,每次5 min,滴加DAPI封片剂,室温孵育30 min。镜下观察。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 LINGO-1对脊髓神经干细胞克隆球直径的影响

神经克隆球的直径大小可以反映出分离原代培养脊髓神经干细胞固有的增殖能力。实验显示对照组及LINGO-1干扰组克隆球大部分在含有EGF和bFGF的培养液中悬浮生长(见图1),另有少量细胞贴壁生长。加入新鲜培养液及因子(EGF及bFGF)继续培养1周可见中等大小的圆形细胞克隆团形成,细胞形态规则,折光性好,未见明显突起(见图1)。培养1周LINGO-1干扰组的克隆球直径[(118±8.9)%]明显大于对照组[(100±6.3)%],差异有统计学意义(见图1)。

图1 脊髓来源神经干细胞细胞克隆球生长情况(×40)Figure1 CultureofSNSCsincontrolgroupandsiNRAgroup(×40)

2.2 下调LINGO-1促进脊髓干细胞增殖

脊髓来源培养的神经干细胞干扰后经BrdU标记24 h观察到对照组BrdU阳性细胞(红色细胞)较LINGO-1干扰组BrdU阳性细胞(红色细胞)明显减少(见图2)。进一步分析结果显示对照组及LINGO-1干扰组BrdU阳性细胞率分别为3.8%及8.5%,两组相比较差异有统计学意义(P<0.05,见图2G)。

与对照组比较，∗P<0．05G．统计分析图2 LINGO⁃1干扰组及对照组SNSCs的Brdu染色及比较(×20)Figure2 BrdUstainingofSNSCsincontrolgroupandsiNRAgroup(×20)

2.3 下调LINGO-1抑制神经干细胞凋亡

脊髓来源培养的神经干细胞干扰后经TUNEL染色后观察到对照组TUNEL阳性细胞(绿色细胞)较LINGO-1干扰组TUNEL阳性细胞(绿色细胞)明显增多(见图3)。进一步分析结果显示对照组及LINGO-1干扰组绿色荧光阳性细胞率分别为11.2%及8.4%,两组相比较有统计学差异(P<0.05,见图3G)

与对照组比较，∗P<0．05G．统计分析图3 LINGO⁃1干扰组及对照组TUNEL染色结果及比较(×20)Figure3 TUNELstainingofSNSCsincontrolgroupandsiNRAgroup(×20)

3 讨论

本实验成功从成年大鼠脊髓中分离培养了原代神经干细胞,并利用LINGO-1 shRNA对脊髓神经干细胞进行干预,观察到干扰后的神经克隆球形成能力高于对照组。进一步观察提示下调LINGO-1基因的表达可以促进脊髓神经干细胞增殖同时减少其凋亡,此结果为脊髓损伤后早期干预增加内源性脊髓神经干细胞提供体外实验证据,也为进一步促进脊髓损伤后神经修复带来希望。

脊髓损伤后出现以神经元坏死、神经传导束崩解为主要表现的起始损伤和炎症反应为主要表现的二次损伤,在第一阶段中神经传导束崩解产物进一步分解成为以Nogo-A、MAG和OMgp为代表的髓鞘源性抑制因子(myelin-associated inhibitory factors,MAIFs),研究表明此类因子可以通过其复合受体之一LINGO-1介导了多种不利于神经损伤修复的生物学作用[4]。LINGO-1是由614个氨基酸构成的跨膜生物蛋白,包括12个富亮氨酸重复序列,1个Ig区,1个跨膜区和1个短小的胞浆区[5]。研究表明,LINGO-1可以通过NgR1/P75/LINGO-1或NgR1/Troy/LINGO-1调控RhoA途径,终使生长锥塌陷而使轴突再生受阻;也可以参与并下调EGFR,从而影响Akt通路而调控神经元存活;还可以少突胶质细胞成熟及再髓鞘化[6]。抑制LINGO-1基因功能可以促进脊髓损伤后神经功能的恢复[7],但是LINGO-1对脊髓神经干细胞的增殖及凋亡作用却未见相关报道。

神经克隆球的直径大小可以反映出神经干细胞固有的增殖能力,实验结果显示LINGO-1对克隆球直径具有负性作用,经过LINGO-1 shRNA干扰后克隆球直径明显大于对照组。Lööv等[8]在其试验中曾观察到应用LINGO-1抗体后,NSCs中BrdU阳性细胞明显增多,这与本实验所观察到的结果一致,随着LINGO-1功能受到了抑制,NSCs增殖加快,进而形成克隆球的直径也会高于对照组。

进一步检测LINGO-1对神经干细胞增殖的影响提示抑制LINGO-1基因的表达可以促进脊髓神经干细胞增殖。本实验通过LINGO-1 shRNA干扰后BrdU阳性细胞率从3.8%提高至8.5%,提高达2倍之多,这提示LINGO-1 shRNA对脊髓神经干细胞具有负性调控作用。Lööv等[8]对皮层来源的神经干细胞也进行过干预检测,采用LINGO-1特异性抗体对LINGO-1进行功能封闭,发现BrdU阳性细胞率从5%提高至18%,提高达3倍有余,造成这一差异的原因可能是脊髓和脑皮层来源的神经干细胞本身生物学差异造成的。除了检测LINGO-1基因对脊髓神经干细胞的增殖作用外,同时也检测其对凋亡的作用,显示抑制LINGO-1基因的表达可以降低脊髓神经干细凋亡。本实验通过LINGO-1 shRNA干扰后TUNEL阳性细胞率从11.2%下降至8.4%,这与Zhang等[9]在神经元中观察到的结果一致。Zhang等[9]进一步发现这一作用是通过LINGO-1胞内段直接作用蛋白WNK3来完成的,LINGO-1可以激活WNK3的自身磷酸化活性,进而发生Caspase-3依赖性凋亡。

本研究没有进一步检测LINGO-1影响SNSCs增殖及凋亡所可能涉及的通路,这也是本研究下一步所努力的方向。明确LINGO-1对脊髓神经干细胞增殖及凋亡的影响,可以更加广泛地了解LINGO-1的生物学功能,也为进一步促进脊髓损伤后神经修复提供可能的作用靶点,为治疗脊髓损伤带来更多的希望。

[1] Stenudd M,Sabelström H,Frisén J.Role of endogenous neural stem cells in spinal cord injury and repair[J].JAMA Neurol,2015,72(2):235-237.

[2] Ji B,Li M,Wu WT,etal.LINGO-1 antagonistpromotes functional recovery and axonal sprouting after spinal cord injury[J].Mol Cell Neurosci,2006,33(3):311-320.

[3] Zhao XH,Jin WL,Wu J,etal.Inactivation of glycogen synthase kinase-3beta and up-regulation of LINGO-1 are involved in LINGO-1 antagonist regulated survival of cerebellar granular neurons[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28(5):727-735.

[4] GrandPré T,Nakamura F,Vartanian T,etal.Identification of the Nogo inhibitor of axon regeneration as a Reticulon protein[J].Nature,2000,403(6768):439-444.

[5] Mi S,Lee X,Shao Z,etal.LINGO-1 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex[J].Nat Neurosci,2004,7(3):221-228.

[6] Mi S,Hu B,Hahm K,etal.LINGO-1 antagonist promotes spinal cord remyelinationand axonal integrity in MOG-induced experimentalautoimmune encephalomyelitis[J].Nat Med,2007,13(10):1228-1233.

[7] Ji B,Li M,Wu WT,etal.LINGO-1 antagonist promotes functional recovery and axonal sprouting after spinal cord injury[J].Mol Cell Neurosici,2006,33(3):311-320.

[8] Lööv C,Fernqvist M,Walmsley A,etal.Neutralization of LINGO-1 duringinvitrodifferentiation of neural stem cells results in prolife-ration of immature neurons[J].PLoS One,2012,7(1):e29771.

[9] Zhang Z,Xu X,Xiang Z,etal.LINGO-1 promotes neuronal apoptosis by inhibiting WNK3 activity[J].J Biol Chem,2013,288(17):12152-12160.

Effects of LINGO-1 on proliferation and apoptosis of spinal cord derived neural stem cells

ZHAO Chenguang1,XU Gang2,JU Fen1,SUN Wei1,YUAN Hua1,MOU Xiang1*

(1DepartmentofRehabilitation,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2OrthopedicCenterofChinesePLA,GeneralHospitalofXinjiangMilitaryRegion;*Correspondingauthor,E-mail:Pro.mu@fmmu.edu.cn)

ObjectiveTo investigate the effects of LINGO-1 on proliferation and apoptosis of spinal cord derived neural stem cells(SNSCs).MethodsSNSCs isolated from rat spinal cord were culturedinvitroand divided into RNAi group and control group.SNSCs were transfected with LINGO-1 shRNA lentiviral vector in RNAi group and blank lentiviral vector in control group.The effects of LINGO-1 on proliferation and apoptosis were examined by BrdU and TUNEL staining.ResultsAfter down-regulation of LINGO-1 expression,the diameter of neurospheres in siNRA group was 1.18 times over that of the diameter in control group(P<0.05).The BrdU positive cell rate in RNAi group and control group was 8.5% and 3.8%,respectively(P<0.05),and the TUNEL positive cell rate in in RNAi group and control group was 8.4% and 11.2%(P<0.05).ConclusionDown-regulation of LINGO-1 gene could increase proliferation of SNSCs and decrease apoptosis of SNSCs.

LINGO-1； spinal cord derived neural stem cells； spinal cord injury； proliferation； apoptosis

国家自然科学基金资助项目(81100932);中国博士后科研基金资助项目(20100481518);陕西省国际合作项目(2015KW-035)

赵晨光,男,1981-05生,博士,主治医师

2016-11-16

R329.2

A

1007-6611(2017)03-0222-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.03.005