社区获得性尿道致病性大肠埃希菌毒力基因检测及其与预后的相关性研究

茅国峰，骆振刚

·论著·

·临床用药分析·

社区获得性尿道致病性大肠埃希菌毒力基因检测及其与预后的相关性研究

茅国峰1*，骆振刚2

目的 了解社区获得性尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)的毒力基因及耐药性，探讨毒力基因与疾病预后的相关性。方法 收集2013—2014年于绍兴市人民医院治疗的尿路感染(UTI)患者56株社区获得性UPEC，采用纸片扩散法(K-B法)和微量稀释法进行药敏试验，按照美国临床与实验室标准协会(CLSI)制定的药敏试验标准(2014年版)判读药敏试验结果。PCR法检测P菌毛亚单位A(papA)、细胞毒素坏死因子1(cnf1)、细胞毒素坏死因子2(cnf2)、定植因子抗原B(cfaB)、侵袭质粒抗原B(ipaB)、hofQ、ompT毒力基因，并结合临床资料分析患者的疾病进展和转归情况。结果 56株社区获得性UPEC共检测到ompT毒力基因阳性菌株20株(35.7%)，papA毒力基因阳性菌株4株(7.1%)，未检测到其他毒力基因。ompT毒力基因阳性和阴性菌株均未发现对哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南、丁胺卡那霉素、厄他培南、亚胺培南和替加环素存在耐药性。ompT毒力基因阳性菌株对头孢他啶的耐药率高于阴性菌株，差异有统计学意义(P<0.05)。药物治疗后1周，20例ompT毒力基因阳性患者未治愈15例(75.0%)，出现复发症状者11例(55.0%)；36例ompT毒力基因阴性患者未治愈10例(27.8%)，出现复发症状者6例(16.7%)。ompT毒力基因阳性与阴性患者未治愈及复发患者比例比较，差异均有统计学意义(χ2=11.601、8.936，P<0.05)。结论 社区获得性携带ompT毒力基因的UPEC可能与其对头孢他啶的耐药性有关，菌株毒力强，易反复感染。

尿路致病性大肠埃希菌；社区获得性感染；毒力；耐药性

茅国峰，骆振刚.社区获得性尿道致病性大肠埃希菌毒力基因检测及其与预后的相关性研究[J].中国全科医学，2017，20(8)：984-987.[www.chinagp.net]

MAO G F，LUO Z G.Virulence genes in community-acquired uropathogenic escherichia coli and its correlation with the prognosis of the disease[J].Chinese General Practice，2017，20(8)：984-987.

临床90%以上无并发症的尿路感染(UTI)患者由尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)引起[1]，而毒力基因可加强UPEC的致病力和侵袭力。为了解本地区社区获得性女性急性膀胱炎患者UPEC毒力基因的存在情况及其与疾病预后的相关性，本研究检测收集到的56株UPEC P菌毛亚单位A(papA)、细胞毒素坏死因子1(cnf1)、细胞毒素坏死因子2( cnf2)、定植因子抗原B(cfaB)、侵袭质粒抗原B(ipaB)、hofQ、ompT毒力基因，并比较毒力基因阳性菌株与阴性菌株感染患者治疗效果和复发情况，探讨其相关性。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2013—2014年于绍兴市人民医院治疗的UTI患者56株社区获得性UPEC，患者均为女性急性膀胱炎患者，入院48 h内分离出UPEC，且患者1年内无住院史，无长期留置导尿管或侵入性器械操作史。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定及药敏试验 菌株鉴定采用法国生物梅里埃公司生产的Vitek-2细菌鉴定仪鉴定，药敏纸片为英国OXOID公司产品，M-H培养基采用法国生物梅里埃公司产品。药敏试验采用纸片扩散法(K-B法)和微量稀释法，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC70060，均购自原卫生部临床检验中心，按照美国临床与实验室标准协会(CLSI)制定的药敏试验标准(2014年版)[2]判读药敏试验结果。

1.2.2 PCR法检测毒力基因 PCR法检测papA、cnf1、cnf2、cfaB、ipaB、hofQ、ompT毒力基因。煮沸法提取DNA模板，扩增引物序列参考文献[3]，PCR反应体系25 μl，其中10×Buffer 2 μl，dNTP 2 μl，引物各1 μl，DNA聚合酶0.25 μl，DNA模板2 μl，剩余体积用无菌双蒸馏水补足。PCR反应条件：93 ℃预变性2 min；93 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸1 min。PCR产物置于2%琼脂糖凝胶中(含0.5 μg/ml溴化乙啶)，电压120 V，电泳40 min，采用凝胶成像仪观察结果，出现与阳性对照分子相当的目的条带为阳性。

1.2.3 治愈和复发的判定标准 急性膀胱炎症状为尿频、尿急和排尿不适。采用三日疗法治疗，3 d后追踪1周，若症状消失则为治愈。在治愈后的6周内再次出现同一细菌的感染则为复发。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计数资料的分析进行χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 毒力基因检测 56株社区获得性UPEC共检测到ompT毒力基因阳性菌株20株(35.7%)，目标产物长度为373 bp； papA毒力基因阳性菌株4株(7.1%)，目标产物长度为430 bp，未检测到其他毒力基因，电泳结果见图1、2。

注：M为DNA标准带，P为阳性对照，S1、S2为阳性标本，N为阴性对照

注：M为DNA标准带，P为阳性对照，S1、S2为阳性标本，N为阴性对照

2.2 药敏试验 ompT毒力基因阳性和阴性菌株均未发现对哌拉西林/他唑巴坦、美洛培南、丁胺卡那霉素、厄他培南、亚胺培南和替加环素存在耐药性。ompT毒力基因阳性菌株对头孢他啶的耐药率高于阴性菌株，差异有统计学意义(P<0.05)。ompT毒力基因阳性和阴性菌株对余抗菌药物的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

2.3 毒力基因与疾病预后的关系 药物治疗后1周，20例ompT毒力基因阳性患者未治愈15例(75.0%)，出现复发症状者11例(55.0%)；36例ompT毒力基因阴性患者未治愈10例(27.8%)，出现复发症状者6例(16.7%)。ompT毒力基因阳性与阴性患者未治愈及复发患者比例比较，差异均有统计学意义(χ2=11.601、8.936，P<0.05)。4例papA毒力基因阳性患者均未治愈。

3 讨论

病原性细菌致病能力的强弱程度称为毒力，侵袭力和毒素构成细菌毒力，其物质基础是细菌的菌体结构和代谢产物。菌体结构包括菌体表面的黏附结构，如纤毛、外膜、水解酶等；毒性代谢产物包括脂多糖、蛋白等。UPEC具有多种毒力基因，包括papA、cnf1、cnf2、cfaB、ipaB、hofQ、ompT等，由位于染色体上的致病岛基因编码[3]。80%以上的UPEC具有P菌毛，P菌毛可与人泌尿道黏膜上皮细胞表面的特异性受体结合，促使细胞黏附定植，是UPEC致病的首要条件。而外膜蛋白ompT是革兰阴性杆菌，尤其是大肠埃希菌的重要防御分子，属于omptins蛋白家族的原型，位于大肠埃希菌外膜，是一种丝氨酸蛋白酶。有研究表明，ompT在UTI的发病机制中发挥了重要作用，包括增加细菌的黏附和侵袭、促进胞内菌落的形成和上调促炎细胞因子等[4]。另外，cfaB基因属于黏附素，是主要菌毛亚单位；cnf1是一种皮肤坏死毒素；cnf2是一种导致腹泻和败血症的坏死毒素；ipaB基因属于侵袭素，常导致细菌性痢疾；hofQ基因是一种菌毛转运体，属于外膜蛋白。

本研究显示，社区获得性UPEC papA毒力基因阳性率为7.1%，ompT毒力基因阳性率为35.7%，而汪一萍等[5]对31株多重耐药UPEC检测ompT毒力基因阳性率为48.4%，结果差异可能与菌株构成不同有关。同时本研究还比较了OmpT毒力基因阳性菌株与阴性菌株的耐药率，两种菌株对大部分抗菌药物均显示了较低的耐药率，除2株(10.0%)ompT阳性菌株出现对呋喃妥因耐药性外，余未发现UPEC对丁胺卡那霉素和呋喃妥因存在耐药性，是治疗UTI有效的抗菌药物[6]，且未发现对碳青霉烯类和替加环素有耐药菌株，与国外报道相似[7]，对含酶抑制剂的β-内酰胺类抗菌药物的耐药率低于陈中举等[8]报道的结果，可能与地区差异有关。复方磺胺甲噁唑和喹诺酮类药物是治疗女性急性膀胱炎的经验用药[9]，但本研究显示，两种菌株对上述药物均有较高的耐药率，对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率均超过50.0%，说明在本地区上述药物并不一定是UTI的首选用药。除头孢他啶外，ompT毒力基因阳性菌株和阴性菌株对抗菌药物的耐药率无差异，提示UPEC毒力基因与耐药率可能无相关性。

为了解毒力基因与疾病预后的相关性，本研究对分离到菌株的患者治疗效果和复发情况进行了分析。ompT毒力基因阳性菌株的治愈率低于阴性菌株，而复发率高于阴性菌株。4例papA毒力基因阳性患者均未治愈。

本研究也存在一定的局限性，性别、年龄、合并其他基础疾病、预防性使用抗菌药物等均是患者UTI治疗效果的影响因素，其治疗效果也可能是多种因素共同作用的结果[10-11]。今后将通过多中心、大样本的单因素和多因素Logistic回归分析，探究影响UTI预后的相关因素。

作者贡献：茅国峰、骆振刚进行课题设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；茅国峰进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

表1 ompT毒力基因阳性菌株和阴性菌株对抗菌药物的耐药率比较〔n(%)〕

注：-未进行假设检验

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(本文编辑：吴立波)

Virulence Genes in Community-acquired Uropathogenic Escherichia coli and Its Correlation with the Prognosis of the Disease

MAOGuo-feng1*，LUOZhen-gang2

1.DepartmentofClinicalLaboratory,ShaoxingPeople′sHospital,Shaoxing312000,China2.DepartmentofUrologySurgery,ShaoxingPeople′sHospital,Shaoxing312000,China

*Correspondingauthor：MAOGuo-feng，Seniortechnologist；E-mail：gfmaomao@126.com

Objective To understand the virulence gene and drug tolerance of community-acquired UPEC and explore the correlation between virulence gene and the prognosis of the disease.Methods We collected 56 strains of community-acquired UPEC from patients with urinary tract infection(UTI) who received treatment in Shaoxing People′s Hospital from 2013 to 2014.We conducted drug sensitive test by K-B method and microdilution method.The results of the drug sensitive test were determined according to CLSI 2014 drug sensitive test standard.Virulence genes were detected by using PCR，including papA，cnf1，cnf2，cfaB，ipaB，hofQ and ompT.Analysis of disease development and relapse was performed based on clinical data.Results Among the 56 strains of UPEC，we found 20(35.7%) ompT-positive strains and 4(7.1%) papA-positive strains;no other virulence genes were found.ompT-positive strains and ompT-negative strains had no drug resistance to piperacillin/tazobactam，meropenem，amikacin，ertapenem，imipenem and tigecycline.ompT-positive strains had higher drug resistance rate to ceftazidime than ompT-negative strains(P<0.05).One-week after medication，15(75.0%) patients did not cure and 11(55.0%) patients had relapse among 20 patients with ompT-positive strains;10(27.8%) patients did not cure and 6(16.7%) patients had relapse among 36 patients with ompT-negative strains.There were significant differences in the rate of not being cured and relapse between patients with ompT-positive strains or papA-negative strains(χ2=11.601，8.936;P<0.05).Conclusion Community-acquired UPEC carrying ompT may be related to its resistance to ceftazidime，and the strains have strong virulence，and usually cause repeated infections.

Uropathogenic escherichia coli；Community-acquired infections；Virulence；Drug resistance

浙江省科技厅公益技术应用研究项目(2014C33255)

R 378.21

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.08.y05

2016-04-11；

2016-12-21)

1.312000浙江省绍兴市人民医院检验科

2.312000浙江省绍兴市人民医院泌尿外科

*通信作者：茅国峰，主任技师；E-mail：gfmaomao@126.com