右归饮影响大鼠膝骨关节炎疼痛的实验研究

唐国根 褚 强 陈 彦 陈军军 金鑫奇 陆超峰

1 浙江省余姚市中医医院 浙江 余姚 315400

2 浙江省绍兴市中医院 浙江 绍兴 312499

右归饮影响大鼠膝骨关节炎疼痛的实验研究

唐国根1褚 强1陈 彦1陈军军1金鑫奇1陆超峰2#

1 浙江省余姚市中医医院 浙江 余姚 315400

2 浙江省绍兴市中医院 浙江 绍兴 312499

右归饮 膝骨关节炎 疼痛 大鼠 实验研究

近期临床观察中发现，右归饮对于缓解膝关节疼痛效果较好，但机制不明确。对此，笔者使用右归饮干预影响大鼠膝骨性关节炎疼痛，旨在证实右归饮能缓解膝关节炎疼痛症状，并探讨相关机制。报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物:健康SPF级4周龄SD大鼠36只，体质量80±5g（实验动物由浙江中医药大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:ACXK(沪)2013-0016）。实验过程中对动物的处置符合浙江中医药大学实验动物处置伦理学标准。

1.2 药物与试剂:戊巴比妥钠（中国医药集团上海化学试剂公司提供,批号:F20020915）；注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司，批号:F3117217)；0.9%氯化钠注射液（中国大冢制药有限公司，批号:5G70J3）；Trizol Reagent（美国Invit rogen公司）；SYBR荧光定量试剂盒、反转录试剂盒(日本Takara公司)。

1.3 实验仪器:YLS-3E电子压痛仪（安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司）；Real-time PCR仪(Eppendor f公司，德国)；石蜡包埋机（thermo公司，美国）；组织脱水机（sakura公司，日本）、组织切片机（thermo公司，美国）。

1.4 实验方法:分述如下。

1.4.1 药物制备:右归饮由熟地、制附子各9g，枸杞、炒山药、姜杜仲、肉桂、炙甘草各6g，山茱萸3g组成。称取60倍处方量，加20L水浸泡3h，于密闭式高压自动煎药锅内煎煮、提取，将提取液过滤后放冰箱内冷藏12h，以4000r/min、4℃下离心15min，反复过滤、离心2次，合并上清液，加热至沸腾浓缩，随后60℃减压干燥过夜，最终得1g干膏含5g生药，真空包装保存备用。右归饮干膏的制备由杭州胡庆余堂制药厂完成。

1.4.2 动物造模及分组:实验通过切断内侧副韧带联合内侧半月板切除造成关节不稳的方法建立大鼠骨性关节炎模型[1]。大鼠按0.3ml/100g的1%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉，固定、消毒后，沿髌韧带内侧切开，切断内侧副韧带，暴露关节髁间区，切除内侧半月板，逐层缝合，术后不固定肢体，自由活动，膝关节注射青霉素预防感染；36只大鼠随机分成3组，对照组、模型组、右归饮组各12只，其中对照组不做任何造模处理。

1.4.3 干预方法:造模成功后开始进行分组处理:对照组大鼠正常饲养，不给予任何处理，每天灌右归饮等量的生理盐水。模型组大鼠造模成功后，每天灌右归饮等量的生理盐水，自由活动，正常饲养。右归饮组按照“人-大鼠体表面积比值”折算成人日用临床剂量,生药20g/ kg，造模后每天给予浓度为2.5g/ml的右归饮10ml/kg灌胃，每天1次，连续4周，四肢自由活动，正常饲养，分批于第2周、第4周处死。

1.4.4 机械痛阈值测定:将大鼠膝关节伸直位固定于电子压痛仪的尖型压头下，进行逐步加压，当大鼠因膝关节疼痛出现挣扎鸣叫时停止加压，此时显示的压力值为痛阈值。实验干预开始前1天测定基础痛阈，于干预后第2周、第4周，测量痛阈值变化，每条腿反复测量3次。

1.4.5 病理切片制作:实验结束后每组大鼠双侧膝关节取部分滑膜组织，随后4%多聚甲醛溶液固定24h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规3μm切片，行苏木精-伊红（HE）染色，观察各组滑膜组织病理特征。

1.4.6 Real-time PCR检测白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达:将双侧膝关节滑膜分离，PBS冲洗3次，随后液氮研磨成粉状，Trizol提取各组标本总RNA，逆转录试剂盒逆转录成10μl体系cDNA，采用SYBR反应体系:SYBR green 5μl，Primer (mix)10μmol/L 1μl，RNase-Free Water 3μl，cDNA 1μl进行Real-time PCR反应，每个样本设3个复孔，以GAPDH作内参，检测各组IL-1β和TNF-α的表达水平，各基因mRNA表达用2-ΔΔCt计算结果来表示。

1.5 统计学方法:采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，采用t检验，并进行组间两两比较,以P＜0.001为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠膝关节机械痛阈值比较:见表1。

表1 各组大鼠膝关节机械痛阈值（±s）

表1 各组大鼠膝关节机械痛阈值（±s）

注:与对照组比较,*P＜0.001；与模型组比较,＃P＜0.001。

时间2周4周对照组585.3±45.5 623.9±32.6模型组198.4±30.1*180.9±23.2*右归饮组380.9±26.5*#374.8±28.6*#

图2 各组膝关节滑膜组织的HE染色(×50)

2.2 膝关节滑膜组织HE染色结果:见图2。正常对照组大鼠滑膜均未见明显炎症反应，无炎性细胞浸润可见少量成纤维细胞及血管组织。模型组滑膜组织可见大量炎性细胞浸润伴纤维组织增生，未见明显滑膜细胞增生，且4周时炎性细胞多于2周。右归饮组滑膜炎性细胞浸润少于模型组，能抑制纤维组织增生，2周与4周无明显差异。

2.3 膝关节滑膜组织IL-1β和TNF-α的mRNA表达结果比较:见表2。

表2 各组大鼠膝关节滑膜组织IL-1β和TNF-α的mRNA表达（±s）

表2 各组大鼠膝关节滑膜组织IL-1β和TNF-α的mRNA表达（±s）

注:与对照组比较,*P＜0.001；与模型组比较,＃P＜0.001。

组别对照组模型组右归饮组例数12 12 12 IL-1β mRNA表达2周1.01±0.19 6.84±1.18*3.46±0.40#*4周1.11±0.25 8.12±0.40*3.38±0.47#*TNF-α mRNA表达2周1.06±0.39 11.28±1.50*6.11±0.57#*4周1.15±0.24 7.56±0.78*6.61±0.84*

3 讨论

膝骨性关节炎是一种好发于中老年人的退行性骨关节病，主要特征为软骨退变继发骨质增生，临床症状以关节疼痛、肿胀、僵硬及活动受限为主。目前对于膝关节疼痛治疗的方法有很多，包括玻璃酸钠关节腔注射,口服消炎镇痛药、中药，使用针灸、小针刀治疗等。本病属于中医学中“痹症”范畴，多由肝肾亏虚，挟带劳损或风寒湿邪，造成气滞血瘀、经络痹阻，导致关节疼痛、肿胀，其本为虚，因此在治疗时多采用补益肝肾、祛风除湿、散寒活血等治法。右归饮出自《景岳全书》，具有温补肾阳、补血益精的作用，对治疗痹症有很好的临床疗效。膝关节疼痛多与炎症反应有关，IL-1β和TNF-α是常见的促炎细胞因子。Kobayashi等[2]研究已证实，膝关节炎患者的关节液中IL-1β和TNF-α含量明显增高。亦有研究发现，兔膝关节炎模型中，滑膜组织中IL-1βmRNA表达增高,本实验通过RT-PCR对大鼠膝关节滑膜组织的IL-1β及TNF-α的mRNA表达量研究发现，与对照组相比较，模型组与右归饮组中膝关节滑膜组织的IL-1β和TNF-α的mRNA表达均有提高，其差异均具有统计学意义（P＜0.001），与模型组相比，2周和4周的右归饮组膝关节滑膜组织中IL-1β的mRNA表达差异具有统计学意义（P＜0.001）,2周右归饮组膝关节滑膜组织中TNF-α的mRNA表达差异具有统计学意义（P＜0.001），但是4周的右归饮组膝关节滑膜组织中TNF-α的mRNA表达与模型组相比无统计学意义（P=0.0705）。说明相比于模型组，右归饮能够降低IL-1β和TNF-α的mRNA表达。

综上所述，本实验结果表明，右归饮能有效缓解膝骨关节炎关节疼痛，主要通过抑制膝关节滑膜组织炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的基因表达，达到抑制膝关节疼痛的作用。

[1]Bendele AM.Animal models of osteoar thritis[J].J Musculoskelet Neuronal Interact，2001，1(4):363-376.

[2]Kobayashi M1,Squires GR,Mousa A,et al.Role of inter leukin-1 and tumor necrosis factor alpha in mat rix degradation of human osteoar thritic car ti lage [J].Ar thritis Rheum，2005，52(1):128-135.

2016-09-05

# 通讯作者：陆超峰，E-mail：ivanyc1109@foxmai l.com