升白汤对60Co射线所致小鼠骨髓有核细胞周期的影响

朱惠香 张荷萍 龚海英

浙江省义乌稠州医院 浙江 义乌 322000

升白汤对60Co射线所致小鼠骨髓有核细胞周期的影响

朱惠香 张荷萍 龚海英

浙江省义乌稠州医院 浙江 义乌 322000

升白汤 60Co射线 骨髓 细胞周期 实验研究

近年来由于种种原因，白细胞减少症的发生率正呈逐步上升趋势，是临床医生经常要面临的医疗问题。本院自拟的经验方“升白汤”为基本方辨证分型加减，该方为健脾补肾、益气生血方，在临床升白治疗中有一定疗效。为进一步观察升白汤对白细胞减少症的作用，本文考察了该方对骨髓有核细胞周期的影响，以便进一步明确升白汤对辐射损伤所致白细胞减少的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料:分述如下。

1.1.1 实验动物:清洁级ICR小鼠，雄性，共85只，6～8周龄，体质量18～22g，由浙江省中医药研究院实验动物中心提供（合格证号:SYXK(浙)2014-0003）。

1.1.2 实验药品:①升白汤:生黄芪、黄精、仙鹤草各30g，仙灵脾、鸡血藤各15g，女贞子、当归各12g。以上中药用水浸泡10小时后，再行煎煮，共2次，每次1小时，合并煎液，离心，浓缩，分别稀释至药液浓度为3.80g生药/ml、1.90g生药/ml、0.95g生药/ml 3种浓度,分别相当于成人用量的16倍、8倍、4倍。②利可君片（购于江苏吉尔贝药业，批号150606），临用前用蒸馏水溶解稀释，配成1mg/ml的溶液。

1.1.3 主要仪器:酶标仪（Bio-RAD公司680，美国）；台式离心机（Biofogepico，Heraeus公司，德国）；电子天平（METTLER TOLEDO AB204-S，瑞典）；解剖显微镜（OLYMPUS SZ-11，日本）；生物显微镜（OLYMPUS，CHK2-FGS日本）。

1.1.4 主要试剂:小鼠γ干扰素（中美生命科技公司，批号:E0049m）；小鼠粒细胞因子（中美生命科技公司，批号:E0045m）；冰醋酸（分析纯，杭州化学试剂厂，批号: 150626）。

1.2 分组及给药:分述如下。

1.2.1 动物分组:85只小鼠，随机共分6组，正常组10只，模型组、升白汤大剂量组、中剂量组、小剂量组及利可君组（阳性组）随机各15只。

1.2.2 给药方式:正常组、模型组:灌胃给予生理盐水25ml/kg，1次/日。大剂量组:升白汤3.8g生药/ml灌胃，1次/日。中剂量组:升白汤1.9g生药/ml灌胃，1次/日。小剂量组:升白汤0.95g生药/ml灌胃，1次/日。阳性组:利可君20mg/kg、1mg/ml灌胃，1次/日。

1.3 造模:以上各组灌胃14天后，除正常组外，其余各组均施行一次性60Co射线全身照射，吸收总剂量为3.5Gy，由浙江省农科院辐照中心施行。

1.4 骨髓有核细胞周期的测定：于照射造模后14天，处死动物，分离出2侧股骨。取左侧股骨中段7mm，用0.005mol/LCaCl2溶液10ml将全部骨髓冲入离心管内，捣碎，加生理盐水混悬，将细胞以1×106接种于60mm培养板，80%汇合后转染。24小时后在新鲜培养液中加入适当的抗生素（真核表达载体上的抗性标记）进行培养，48小时后用胰酶消化收集细胞，PBS洗两遍，弃上清，加入1ml 70%预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定12小时以上。PBS洗涤去乙醇，1000rpm,5min，洗两遍。0.5mlPBS重悬细胞，加入PI和RNaseA至终浓度50µg/ml，37℃温浴30min。用流式细胞仪测定周期。

2 结果

2.1 各组实验动物死亡情况:至实验第14天，正常组死亡0只；模型组死亡5只；阳性组死亡3只；升白汤小剂量组死亡1只；升白汤中剂量组死亡2只；升白汤大剂量组死亡3只。

2.2 对小鼠外周血WBC计数的影响:辐射后第3天各辐照组小鼠外周血WBC计数明显减少，与正常组比较差异均有显著性（P＜0.01）。在辐射后第7天，各辐射组与正常组WBC比较差异仍有显著性（P＜0.01）；同模型组比较，升白汤大、中、小剂量组及阳性组小鼠外周血WBC计数无显著性差异（P＞0.05）；同阳性组比较，升白汤三个剂量组小鼠外周血WBC计数差异无统计学意义（P＞0.05）。在辐射后第10、14天，升白汤各剂量组小鼠外周血WBC计数与模型组比较有明显回升，差异有显著性（P＜0.05），其中中剂组与模型组比较，差异更有显著性（P＜0.01）。在辐射后第10天，升白汤各剂量组外周血WBC计数回升与阳性组比较无显著性差异（P＞0.05）；在辐射后第14天，中剂量组与阳性组比较有显著性差异（P＜0.05），大、小剂量组与阳性组比较无显著性差异（P＞0.05）。具体见表1。

表1 升白汤对60Co辐射小鼠WBC计数的影响（±s，×109/L）

表1 升白汤对60Co辐射小鼠WBC计数的影响（±s，×109/L）

注:与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，＄P＜0.05,＄＄P＜0.01；升白汤各组与阳性组比较，#P＜0.05。

组别正常组模型组阳性组小剂量组中剂量组大剂量组例数10 10 12 14 13 12照射后小鼠WBC计数（109/L）3天13.13±3.25 2.33±0.82**2.41±0.63**2.52±0.91**2.46±0.29**2.47±0.76**7天11.46±2.66 1.26±0.73**1.43±0.38**1.50±0.37**1.48±0.74**1.28±0.39**10天10.33±3.05 1.70±0.49 2.52±0.83＄2.49±0.86＄3.02±0.79＄＄2.60±0.44＄14天10.11±2.45 1.79±0.39 2.67±0.83＄2.55±0.72＄3.27±1.33＄＄#2.68±0.79＄

2.3 对小鼠骨髓有核细胞数（BMNC）的影响:接受60Co照射后，各辐射组小鼠骨髓有核细胞计数均较正常组显著减少（P＜0.05）。升白汤三个剂量组及阳性组小鼠的骨髓有核细胞计数较模型组显著增加（P＜0.05），其中升白汤中剂量组BMNC计数与阳性组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。作用强弱顺序为:升白汤中剂量组＞阳性组＞大剂量组＞小剂量组。

2.4 对骨髓有核细胞周期的影响:见表2。

表2 升白汤对60Co辐射小鼠骨髓有核细胞周期的影响（±s）

表2 升白汤对60Co辐射小鼠骨髓有核细胞周期的影响（±s）

注:与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，$P＜0.05。

组别正常组模型组阳性组小剂量组中剂量组大剂量组例数10 10 12 14 13 12细胞周期G0/G1 68.24±3.25 63.15±2.17 60.32±4.47 54.02±2.03*55.69±3.34*56.05±1.58*S 24.02±1.28 27.35±2.56 32.22±1.95*36.02±3.10*$35.69±2.75*$35.62±1.02*$G2/M 6.33±0.36 8.65±1.25*7.32±0.88 10.01±1.03*9.87±0.69*9.98±1.45*PI（%）29.28±1.38 34.85±3.04 38.86±2.41 44.35±5.24*$44.06±2.87*$43.86±2.52*$

3 讨论

白细胞减少症属中医学“虚劳”范畴[1]，其主要病机为脾肾亏损，气血不足。中医学认为，肾主藏精，主骨生髓，精能化血，精血同源，精足则血旺。脾主运化水谷精微，为气血生化之源。因此，人体造血功能与脾肾的关系最为密切。研究表明，健脾补肾和补血养阴的中药对促进骨髓造血有显著疗效[2]。故血虚当从脾肾论治，补益气血，升白汤即集补肾生血、健脾益气于一方。骨髓细胞周期是反映造血系统功能的重要指标之一[3],白细胞减少症患者均不同程度表现出骨髓有核细胞周期的抑制。细胞周期各个时相反映骨髓细胞增殖的状态。在细胞周期调控机制中有两个重要的检查点，分别位于G1期与S期，G2期与M期之间。

实验中发现辐射后小鼠骨髓BMNC数较正常组有明显下降，提示辐射对造血系统损伤明显。各药物干预组同模型组比较，可显著提高小鼠骨髓BMNC计数，其中升白汤中剂量组疗效最显著。BMNC计数在一定程度上反应骨髓造血细胞的增生情况，研究证明升白汤可促进BMNC增加，改善辐射所致的造血系统损害，促进造血功能的恢复。

本研究结果显示，受照后小鼠细胞周期时相表现为S延长及G2期延长，升白汤组与正常组、病理组比较，S期明显延长(P＜0.05)；G2期较正常组亦明显延长。其时相敏感点不同说明了剂量对周期时相有着重要影响。

[1]陈慧娟，李立群.升血汤治疗化疗后白细胞减少症42例疗效观察[J].浙江中医杂志，2013，48(7):510.

[2]梁冰.血液科专科中医临床诊治[M].北京:人民卫生出版社，2000:415-418.

[3]张迪，徐桂华.中药对化疗致白细胞减少症治疗机制研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2012,14（3）:53-55.

2016-11-13