新疆野苹果果肉类黄酮种类及含量分析

何天明+倪蔚茹+刘青++沈向+陈晓流

摘要：以25株新疆野苹果（Malus sieversii）及3个当地苹果品种（嘎啦、夏立萌、红海棠）的成熟果实为试材，利用超高效液相色谱串联四级飞行时间质谱联用仪（UPLC-QTOF-MS）测定了果肉类黄酮物质的组成和含量，结果表明：在新疆野苹果果肉中检测出9种含量较高的类黄酮物质；新疆野苹果与当地品种果肉中检测到的类黄酮组分基本一致，但其含量差异显著；新疆野苹果果肉中绿原酸、原花青素B2、表儿茶素的含量基本均远高于当地品种，其中差异最大的是表儿茶素，其含量最高的GL183是嘎啦含量的82.13倍；新疆野苹果GL026、GL030、GL053-1、GL172、GL179、GL183果肉的绿原酸、原花青素B2、表儿茶素的含量较高，均超过平均水平。

关键词：新疆野苹果；果实；类黄酮；超高效液相色谱串联四级飞行时间质谱联用仪

中图分类号：S661.101文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）03-0046-06

AbstractThe compositions and contents of flavonoids in ripe fruits of 25 strains of Xinjiang wild apple （Malus sieversii） and 3 varieties of local cultivated apple （Gala， Xialimeng and Red Crabapple） were measured using ultra-high performance liquid chromatography & quadrupole-time-of-flight mass spectrometer（UPLC-QTOF-MS）. The results showed that there were 9 kinds of flavonoids with higher contents in Xinjiang wild apple. The compositions of flavonoids in Xinjiang wild apple and local cultivated apple were almost the same， but their contents had significant difference. The contents of chlorogenic acid， procyanidin B2 and epicatechin in Xinjiang wild apple fruit were much higher than those in local cultivated apple， especially epicatechin. Its content was the highest in GL183， which was 82.13 times of that in Gala. And the contents of chlorogenic acid， procyanidin B2 and epicatechin in Xinjiang wild apple strain GL026，GL030，GL053-1，GL172，GL179 and GL183 were higher than the average level.

KeywordsXinjiang wild apple； Fruit； Flavonoids； Ultra-high performance liquid chromatography & quadrupole-time-of-flight mass spectrometer

类黄酮是一类多酚化合物，属植物次生代谢产物，广泛存在于水果、蔬菜中[1]，具有抗菌、抗病毒、消炎、抗过敏、扩张血管等多种生理功能[2，3]，同時具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、过氧化氢等的能力，其清除自由基能力强于维生素C[4]。新疆野苹果[Malus sieversii（Ledeb.）Roem.]是现代栽培苹果（Malus domestica Borkh.）的祖先种，长期的自然选择使单株性状变异较多，遗传多样性丰富，挖掘利用的潜力很大[5，6]。

目前对新疆野苹果类黄酮的研究较多，冯涛等[7]研究新疆野苹果叶片多酚组分发现，新疆野苹果叶片内酚类组分含量和总量在单株之间存在差异，表现出较丰富的遗传多样性；张小燕等[8]对新疆野苹果成熟果实多酚物质组成、含量和遗传多样性进行了研究，鉴定出6种类黄酮物质，原花青素、表儿茶素和根皮苷及绿原酸均为主要多酚物质，含量显著高于栽培苹果品种。高效液相色谱法是类黄酮含量检测的主要方法，利用该方法测定类黄酮的研究已有较多报道[9-12]，但在新疆野苹果的果肉类黄酮组成和含量方面尚需进一步研究。本试验利用高效快速、高分离度的超高效液相色谱串联四级飞行时间质谱联用仪（UPLC-QTOF-MS）对新疆野苹果果肉类黄酮进行研究，分析比较不同单株苹果果肉中类黄酮的种类和含量，以期发现类黄酮组分丰富及含量高的种质资源，并为新疆野苹果种质资源、果实类黄酮利用及高含量类黄酮苹果品种培育的研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料

2014年8月中下旬，从新疆伊犁州巩留县新疆野苹果林标定的200株新疆野苹果植株中随机选取25株，并选取当地野生种红海棠和栽培品种嘎啦、夏立萌各1株，每株采摘成熟果实不低于30个，低温保存带回实验室，进行果肉类黄酮组分及含量的比较。

1.2试剂

甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）；标准品：绿原酸、表儿茶素、原花青素 B2（纯度≥98%，北京北纳创联生物技术研究院）。

1.3试验方法

1.3.1类黄酮的提取削皮机迅速削皮， 果肉纵切， 进行冷冻干燥、粉碎，-70℃保存。精确称取0.300 g果肉冻干磨碎样品， 用4 mL 70%甲醇（含1%甲酸）室温超声提取5 min，常温离心（10 000 r/min， 5 min），取上清，再用3 mL 70%甲醇（含1%甲酸）重复提取一次，合并上清。将上清稀释10倍，过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.2类黄酮的测定液相色谱条件：采用 Waters ACQUITY UPLC 色谱仪，色谱分析柱为BEH T3（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱温45℃。流动相：100% 乙腈（A）、0.1 %甲酸（B），A+B=100%。梯度洗脱程序： 开始8.0% A+92.0%B；20 min，30.0%A+70.0%B；25 min，100.0%A；26 min，100.0%A；26.1 min 8.0%A+92.0%B；30 min， 8.0%A+92.0%B，流速0.3 mL/min。进样量：1 μL。采用Waters ACQUITY PDA检测器。

质谱条件：质谱仪为 Waters MALDI SYNAPT Q-TOF MS，ESI 电离源，电喷雾离子化正离子采集模式（ESI+）。扫描质量范围 50～800 m/z。毛细管电压 3.0 kV，锥孔电压 30 V。离子源温度 100℃，脱溶剂气温度 400℃。脱溶剂气流量 500 L/h。

2结果与分析

2.1类黄酮物质的鉴定

对28株不同的待测样品进行LC-ESI-MS分析，得到每个样品的总离子流色谱图，用MassLynxTM操作软件将LC-ESI-MS数据中每一个数据点转换成质量-保留时间（anexactmass retention time，简称EMRT）数据对，并对数据进行主成分分析，最后总结出在28株不同来源的果实中，共检测分离出9种含量较高的类黄酮物质，结果如图1所示，LC图谱上的各个峰对应的质荷比分别为353.0（3.70 min）、577.1（4.48 min）、289.1（5.32 min）、337.1（5.57 min）、865.1（6.08 min）、463.0（9.20 min）、433.0（10.20 min）、567.0（11.23 min）、435.0（12.95 min）。

分析一级质谱和二级质谱检测结果，结合文献[4]、[8]，初步推测出果肉类黄酮物质为以下化合物（表1）。

如图1和表1所示，3.70 min时，质谱图中出现m/z为353.0的[M-H]-质谱峰，碎片离子中有m/z为191的特征片段，而且还出现了m/z为707的[2M-H]-质谱峰。因此可以推测该物质可能为绿原酸类化合物（隐绿原酸、新绿原酸或绿原酸），根据苹果果实中类黄酮物质种类[4]，推定该物质为绿原酸。4.48 min时，质谱图中显示存在m/z为577.1的[M-H]-质谱峰，由文献[13]可知该物质为黄烷醇二聚体，且二级质谱中有m/z为289的碎片离子，初步推测该物质为原花青素类二聚体化合物，前人研究[14-17]显示，苹果中所含的原花青素二聚体为原花青素B2，因此推測该物质为原花青素B2。5.32 min时，质谱图中显示含有m/z为289.1的分子离子 [M-H]-，加碰撞电压后出现的是表儿茶素和儿茶素的特征片段，根据苹果中所含一般为表儿茶素，推定该物质是表儿茶素。5.57 min时，该物质质谱显示m/z为337.1的分子离子[M-H]-，根据文献[18]可知该物质可能为对香豆酰奎尼酸。6.08 min时，质谱图中显示存在m/z为865.1的[M-H]-质谱峰，由文献[19]可知该物质为黄烷醇三聚体，根据已有研究[20]初步判断该物质可能为原花青素C1。9.20 min时，质谱图中显示m/z为463.0的 [M-H]- ，该物质可能是槲皮素葡萄糖苷或槲皮素半乳糖苷的分子离子，同时，m/z为301的碎片离子为该物质去掉一个六碳糖基的离子峰[M-H-162]-。因此推断该物质可能是槲皮素葡萄糖苷或槲皮素半乳糖苷。10.20 min时，出现m/z为433.0的质谱峰，可能是槲皮素木糖苷或槲皮素阿拉伯糖苷的分子离子峰 [M-H]-，m/z为301的碎片离子是该物质去掉一个五碳糖基的离子峰[M-H-162]-。因此，该物质可能是槲皮素木糖苷或槲皮素阿拉伯糖苷。11.23 min时，m/z为567.0的质谱峰可能是该成分的准分子离子[M-H]-，而m/z为273的碎片离子则是该物质去掉一个六碳糖基的离子，所以推测该物质可能为根皮素木糖葡萄糖苷。12.95 min时，m/z为435.0的质谱峰，可能是该成分的准分子离子[M-H]-，而m/z为273的碎片离子很可能是该成分去掉一个六碳糖基的离子[M-H-162]-，观察加碰撞电压后的质谱图，分子离子峰变小，碎片离子峰变大，综上推测该物质为根皮素葡萄糖苷或根皮素半乳糖苷。

2.2不同样品果肉中可能存在的类黄酮种类的比较

如表2所示，参试的28个样品果肉中共检测到9种类黄酮物质，各样品中类黄酮的种类和含量均不同。绿原酸在所有参试样品中均能检测到。原花青素B2在25个新疆野苹果样品中均大量存在，而在当地野生种红海棠中未检测到，在栽培品种嘎啦、当地栽培种夏立萌果肉中是微量存在的。表儿茶素在25个新疆野苹果果肉样品中均可检测到，其中GL009、GL013、GL017、GL112为微量存在；红海棠果肉中未检测到；嘎啦、夏立萌果肉中均检测到微量存在。对香豆酰奎尼酸在部分新疆野苹果及夏立萌果肉样品中检测到存在，在红海棠和嘎啦果肉中均未检测到。原花青素C1在25个新疆野苹果果肉样品中均可检测到，红海棠和夏立萌果肉中未检测到，而嘎啦果肉中检测到微量存在。槲皮素葡萄糖苷/槲皮素半乳糖苷除在新疆野苹果GL017、GL170和夏立萌果肉中检测到微量存在外，其他样品中均未检测到。槲皮素木糖苷/槲皮素阿拉伯糖苷在新疆野苹果及其它3个当地品种果肉中均未检测到。根皮素木糖葡萄糖苷在新疆野苹果果肉中均存在，其中GL013、GL039、GL129、GL169、GL172均为微量存在；红海棠果肉中未检测到，夏立萌果肉中大量存在，嘎啦果肉中微量存在。根皮素葡萄糖苷/根皮素半乳糖苷除GL053-2未检测到外，其他新疆野苹果果肉中均可检测到，红海棠果肉中未检测到，嘎啦果肉中微量存在，夏立萌中大量存在。

2.3不同样品果肉中类黄酮含量的比较

根据所测样品浓度确定标准品浓度范围，最终将标准品分别配制成1 mg/L溶液，混合标准品，与样品测试相同条件进样，得图2。在混合标准样品的液相色谱图中，绿原酸标准样品保留时间为3.69 min，原花青素B2标准样品保留时间为4.44 min，表儿茶素标准样品保留时间为 5.24 min。通过样品与混合标准样品对比，保留时间的误差分别为：绿原酸0.8%，原花青素B2为1.5%，表儿茶素1.5%，3种类黄酮物质与标准样品保留时间误差均小于2%[21]，可以确认是同一种物质，其他样品中经过比对该3种物质，保留时间误差同样小于2%，因此可以确定3种物质分别为绿原酸、原花青素B2、表儿茶素。

如表3所示，在绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的含量中，新疆野苹果果肉比其他品种果肉含量高，如新疆野苹果绿原酸含量最高的GL053-1是红海棠含量的7.17倍，新疆野苹果原花青素B2含量最高的GL026是夏立萌的109.05倍，新疆野苹果表儿茶素含量最高的GL183是嘎啦含量的82.13倍。在25个新疆野苹果果肉样品中，绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的含量均在新疆野苹果果肉平均含量以上的有6株，分别为GL026、GL030、GL053-1、GL172、GL179、GL183；绿原酸、原花青素B2和表儿茶素的含量均在新疆野苹果果肉平均含量以下的有12个，分别是GL009、GL013、GL017、GL019、GL034、GL038-2、GL039、GL095、GL112、GL170、GL176、GL181，其中GL039、GL095和GL170的绿原酸含量均低于100 μg/g； GL023果肉除了原花青素B2含量在平均含量以上，其余两种类黄酮含量均在平均含量以下； GL028、GL038-1、GL053-2的果肉绿原酸含量均高于平均含量，其他两种类黄酮均低于平均含量； GL129和GL173的果肉绿原酸含量均低于平均含量，原花青素B2和表儿茶素的含量均高于平均含量；GL169的果肉绿原酸和原花青素B2含量低于平均含量，表儿茶素含量高于平均含量。

3讨论与结论

类黄酮属于多酚类物质，是果实中重要的功能性成分，高类黄酮含量的果实具有较高的营养价值和保健作用[22-24]。新疆野苹果是重要的苹果野生资源，张小燕等[8]曾测定新疆野苹果果实中多酚物质的主要组成。本试验测定新疆野苹果果肉类黄酮组成成分，研究组分专一，准确性更高，测定的25个新疆野苹果果肉样品中共检测到绿原酸、原花青素B2、表儿茶素、对香豆酰奎尼酸、原花青素C1、槲皮素半乳糖苷/槲皮素葡糖苷、槲皮素阿拉伯糖苷/槲皮素木糖苷、根皮素木糖葡萄糖苷、根皮素葡萄糖苷/根皮素半乳糖苷9种含量较高的类黄酮物质，与当地栽培品种嘎啦、夏立萌及野生种红海棠品种检测到的组分基本一致，但类黄酮组分含量差异显著。Mayr等[25]发现苹果果肉绿原酸含量平均 20.7 mg/kg，本试验结果表明，新疆野苹果平均绿原酸含量为332.53 μg/g，嘎啦为72.33 μg/g，夏立萌为130.78 μg/g，新疆野苹果果肉绿原酸含量远高于栽培苹果。原花青素是重要的类黄酮物质[26]，王皎等[27]利用HPLC法测定了5个品种苹果中原花青素B2的含量，发现5种苹果果肉的原花青素B2含量在90.19～247.06 μg/g范围内，本试验研究结果表明，新疆野苹果果肉中平均原花青素B2含量为437.23 μg/g，嘎啦果肉中的含量为22.24 μg/g。乜兰春等[28]以富士苹果为试材，利用高效液相色谱研究了果肉表儿茶素含量为60.6 μg/g，本研究结果表明，新疆野苹果平均表儿茶素含量为376.24 μg/g，嘎啦和夏立萌的含量分别为12.76 μg/g和12.19 μg/g。

综上所述，利用超高效液相色谱串联四级飞行时间质谱联用仪检测苹果果实果肉类黄酮物质种类及含量，结果共检测出9种含量较高的类黄酮物质，与当地栽培品种嘎啦、夏立萌及野生种红海棠检测到的组分基本一致；经过绿原酸、原花青素B2及表儿茶素标准品对比及定量研究，结果表明，不同植株新疆野苹果果肉类黄酮含量存在差异，其含量基本均远高于当地栽培嘎啦、夏立萌及红海棠的含量。该结果有利于比较不同单株新疆野苹果果肉类黄酮的种类和含量，筛选类黄酮组分及含量高的种质资源，为进一步进行苹果功能成分育种的珍贵种质提供参考。

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