二维液相色谱法同时检测婴幼儿乳粉中维生素A、E与D3

（广州市质量监督检测研究院，国家加工食品质量监督检验中心广州511447）

二维液相色谱法同时检测婴幼儿乳粉中维生素A、E与D3

岑建斌，区硕俊，周朗君，李秀英

（广州市质量监督检测研究院，国家加工食品质量监督检验中心广州511447）

建立二维高效液相色谱法同时测定婴幼儿乳粉中的维生素A、维生素E（α-生育酚）及维生素D3三种脂溶性维生素的方法，达到快速检测的目的。样品经皂化后用石油醚提取，氮气吹干，并用正己烷定容。维生素A、E经NH2色谱柱分离后切换十通阀，维生素D3继续经Silica色谱柱分离，双二极管阵列检测器进行检测。方法学结果表明，3种维生素在给定的质量分数浓度范围内呈现良好的线性关系，相关线性回归系数r为0.9963～0.9995。平均加标回收率为86.7%～99.6%，相对平均偏差RSD（n=6）为2.07%～4.11%。本方法具有操作简便，灵敏度高，重复性好等优点，适用于奶粉中3种脂溶性维生素含量的日常检测。

十通阀；二维高效液相色谱；同时测定；脂溶性维生素

0 引言

目前婴幼儿乳粉中的维生素A、D、E主要是视黄醇、维生素D3及α-生育酚。这三种维生素对人体均有重要的作用，一但缺乏将导致一系列如夜盲、骨质疏松、易感染、癌症等疾病[1-5]。由于婴幼儿食物来源单一，这三种维生素在乳粉中的含量直接影响婴幼儿的健康，故维生素A、D、E的含量意味着产品质量的优劣，对它们进行监管尤为重要[6-9]。

目前检测维生素AE主要的方法有高效液相色谱法[10-11]、比色法[10]。而维生素D3主要是高效液相色谱法[11]。比色法虽然操作简单，但灵敏度不够，对样品的富集要求高。而目前的高效液相色谱法检测时需要使用正反相两台不同的仪器，耗时耗力，不适用于日常检测[11]。本文建立正相二维液相色谱法[12-15]，简化了维生素D3取馏分的步骤，提高了检测效率[16-17]，该方法回收率高，灵敏度高、重现性好，可以用于检测维生素A、D3、E含量较低的乳粉。

1 实验

1.1仪器与试剂

仪器，Agilent 1260高效液相色谱仪（配置二极管阵列检测器（DAD）2台、四元泵2台、十通阀、1260自动进样器）、IKA MS3涡旋振荡器、KDC-170低速离心机、METTLER TOLEDO XPE 105分析天平、MILLIPORE超纯水系统、JULABO恒温水浴锅、SPECORD 50 PLUS分光光度计、turbovap lv浓缩氮吹仪。

试剂，氢氧化钾、抗坏血酸、石油醚、无水乙醇（分析纯），异丙醇、环己烷、正己烷（色谱纯）、视黄醇标准品（质量分数≥99%）、维生素E标准品（质量分数≥97%）、维生素D3标准品（质量分数≥98.9%）。

1.2色谱条件

第一色谱柱，waters spherisorb®”5 μm 4.6×150mm NH2柱。

第二色谱柱，waters spherisorb®5 μm 4.6×150 mm Silica柱。

A1、B1流动相对应泵1，A2、B2对应泵2，流动相A1和A2均为异丙醇∶环己烷=2∶98，流动相B1和B2均为正己烷。两四元泵总流速均为1.0 mL/min，其中A1、B1、A2、B2对应流速均为0.5 mL/min，柱温25℃；检测波长，维生素A 325 nm，维生素D3264 nm，维生素E 296 nm，进样量50 μL。

1.3标准溶液的制备

称取适量的维生素A，维生素D3，维生素E标准品分别用正己烷配制成质量浓度为50，100和10 mg/L的储备液。使用分光光度计分别在波长325，264和294 nm下校正质量浓度，校正后质量浓度分别为50.1，100.9，10.0 mg/L。分别准确取适量上述储备液，用正己烷稀释成质量浓度分别为0，0.5，2，8，16，32 mg/L和0，20，40，30，80，100 mg/L及0，0.05，0.25，0.5，2.0，4.0 mg/L的混合标准曲线。

1.4样品的前处理

分别准确称取10 g（精确至0.001 g）婴儿乳粉于100 mL棕色具塞比色管中，加入少量温热水（40～60℃）溶解，冷却至常温定容至刻度。取10 mL乳液于50 mL胶质离心管中。加入15 mL质量浓度为15 g/L抗坏血酸-乙醇溶液，3 mL 55%氢氧化钾，充入氮气保护，然后将溶液置于恒温水浴箱中震荡恒温55℃皂化1 h。取出冷却至室温后加入15 mL石油醚涡旋震荡1 min，转速为4 000 r/min离心2 min，吸取上清液石油醚层至100 mL棕色具塞比管中，重复上述提取步骤3次，合并上清液，加入40 mL纯水清洗石油醚提取液，吸取上清液至50 mL试管中，然后氮吹吹至刚好干燥并立即取出。准确加入1 mL正己烷溶解定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤至棕色进样瓶，待测。

2 结果与分析

2.1二维色谱流路构建与切换时间的确定

2.1.1 阀切换时间的确定

要对十通阀进行切换，需要先确定维生素D3在NH2柱的保留时间。在不切换十通阀的情况下，使用标准工作液测试出三种脂溶性维生素在NH2柱的出峰时间，以确定具体的阀门切换方案。维生素A，D3，E在NH2柱中的保留时间如图1所示。由图1可以看出，保留时间分别为14.2，9.0，3.9 min。然后通过维生素D3在NH2柱的保留时间，截取相应时间区间切换到Silica柱。当所有维生素D3切换至Silica柱后，十通阀切换回本来位置由检测器1继续检测维生素A。由于液相色谱出峰时间会有漂移的情况发生，所以在实际应用上，一般截取比出峰的时间区间略大0.2 min的时间范围，阀门切换时间参考如表1所示。

2.1.2 二维色谱流路构建

由于维生素D3在乳粉中含量较低，因此需要进一步的分离与净化，以减少杂质对分析结果的影响。本方法中第一色谱柱采用NH2柱，切换至Silica正相色谱柱，两四元泵采用相同的流动相，具体连接方法如图2所示。维生素A与维生素E于同一检测器检测，维生素D3通过另一检测器检测。十通阀的切换时间由维生素D3保留时间确定，切换后流路如图3所示。

图1 维生素A，D3，E在NH2柱的出峰情况

表1 阀门切换时间

2.2色谱柱的选择

图2 十通阀切换前二维液相流路示意图

图3 十通阀切换后二维液相流路示意图

极性溶剂会对维生素A产生异构作用[18]，本研究采用低极性溶剂正己烷和环己烷，因而采用正相色谱系统。其中维生素A和E在乳粉基质下利用NH2柱分离，在相应出峰时间中干扰较少，响应较高，可满足分析要求。维生素D3在基质干扰下，无法得到峰型良好的目标峰，需要进一步分离。考虑HP-Silica柱固定相含有活性羟基，活性羟基中的孤对电子可与维生素D3中的羟基和发生氢键作用，因而这种范德华力使正相键合硅胶对维生素D3有较好的保留，可以更好地使杂质与之分离，第二色谱柱选择Silica柱。本实验曾探究氰基柱与NH2柱作为一维色谱柱单独对维生素D3的分离效果，发现氰基柱对维生素D3的保留较弱，4 min左右出峰，无法很好地分离杂质，当维生素D3进入Silica柱后，较多杂质进入，造成分离不好、出现大量杂峰等情况。后更换为NH2柱，发现NH2柱对维生素D3的保留更加强，而且满足维生素A与E的检测要求，目标物与杂质均能得到很好的分离，维生素D3的峰型也得到改善。最后得出一维色谱柱为NH2柱，二维色谱柱为HP-Silica色谱柱的结论。具体样品中素维生素D3色谱图如图4所示。

图4 样品中二维柱维生素D3的出峰情况

2.3样品处理条件的选择

2.3.1 不同皂化时间对回收率的影响

维生素A、D3、E属于脂溶性维生素，需要皂化去脂，否则无法有效提取。皂化既要求时间尽可能地短，也需要让反应充分地进行。选定55℃为皂化温度，在此考察0.5，1，2，3，4 h皂化时间对回收率的影响。当皂化时间为0.5 h，维生素A回收率较低，皂化1 h和2 h维生素A、维生素E（α-生育酚）、维生素D3回收率均较高，其中，皂化2 h的实验中维生素A的回收率略高于皂化1 h的实验，维生素D3情况相反，这是由于维生素A、E都具备耐高温的性质，但皂化时间在2 h内，维生素A损失较少，表面包被被破坏及其构型从酯型转化为游离醇型更加充分，致使萃取效率更高。而维生素D3在皂化时间1～2 h的时间区间内，发生少量氧化损失，导致回收率略低1.5%。维生素E的回收率在皂化1 h和2 h的时间内相差不大，在皂化3 h时发现回收率有降低的情况发生。综合考虑到实验效率，时间成本，结果等，显然皂化时间1 h更符合要求，具体结果如图5所示。

图5 不同皂化时间对回收率的影响

2.3.2 不同皂化温度对回收率的影响

选用1 h皂化时间，考察25，40，55，70，85℃条件下，3种维生素的平均回收率。由于25℃和40℃温度较低，导致样品皂化不完全而各种维生素回收率相对较低，从结果看，维生素A在55，75，85均得到良好的回收率；但70℃和85℃会导致维生素D3与维生素E稳定性下降，回收率降低，其中对维生素D3的影响特别明显，结果显示，实验采用55℃的条件较好，具体结果如图6所示。

图6 不同皂化温度对回收率的影响

2.3.3 维生素C-乙醇溶液添加量对回收率的影响

维生素C-乙醇溶液作为体系的抗氧化剂，对维生素A，D3，E有一定的保护作用，所以实验过程要添加一定量该溶液。实验结果显示添加5 mL该溶液，抗氧化性能不足，致使回收率偏低，而又因为3种维生素对酸性条件比较敏感，加入过量维生素C会对回收率产生不良影响，维生素C-乙醇溶液添加15 mL可达到相对较高的回收率，具体结果如图7所示。

图7 维生素C-乙醇溶液添加量对回收率的影响

2.4线性关系和检出限

使用储备液，稀释成不同质量分数的标样，然后以检出浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标制作标准曲线，并计算出线性相关系数r。根据仪器的具体情况，以信噪比（S/N）三倍时的响应浓度作为仪器检出限，信噪比十倍时响应浓度为定量限，详细结果如表2所示。定量限为0.06～3.00 mg/kg可以满足日常乳粉检测的定量需求。

表2 3种脂溶性维生素的线性方程、相关系数（r）和方法检出限

2.5回收率及精密度实验

使用市售婴幼儿乳粉进行样品实验，首先测量出其维生素A，D3，E的质量分数。加标量分别为本底0.5，1，2倍三水平，然后再采用本方法继续进行检测（具体结果参照表3）。结果表明平均加标回收率为86.7%～99.6%，相对平均偏差RSD（n=6）为2.07%～4.11%，表明方法精密度良好。

2.6 F值与t值检验

对某市售婴幼儿乳粉进行方法对比分别用GB5413.9与本方法进行各6次试验，进行比对，以验证本方法是否存在显著性差异。计算得出维生素A、维生素D3、维生素E的F值分别为0.015，0.506，0.475，均小于F0.05，5，5=5.05说明两种方法精密度间不存在显著差异。t值分别为2.122，0.991，和0.571。均小于t0.05，10=2.23。两种方法测定结果无显著性差异。

表3 回收率及精密度实验结果（n=6） μg/100g

3 结论

本研究采用皂化反应法，过程中加入适量维生素C抗氧化，然后采用石油醚对脂溶性维生素A，D，E进行提取；最后采用十通阀构建流路，二维液相色谱净化分离维生素D3，让3种物质能在一台液相色谱仪进行检测。本方法回收率高，灵敏度高，重复性好，操作方便，效率高，方法精密度与测定结果与国家标准无显著差异，适用于婴幼儿乳粉中维生素A、D3、E的日常检测。

[1]柳春红，周韫珍.维生素A、锌、铜、钙对眼组织及视力的影响[J].营养学报，1996（02），175-180.

[2]翦英红，范宁伟，孟令伟，等.反相高效液相色谱法测定植物油样品中的α-维生素E[J].吉林化工学院学报，2016（7），55-58.

[3]陈浩，冯飞，朱富强，等.老年骨折患者25-羟基维生素D和甲状旁腺素与骨质疏松程度的相关性[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志，2013（1），20-27.

[4]廖祥鹏，张增利，张红红，等.维生素D与成年人骨骼健康应用指南（2014年标准版）[J].中国骨质疏松杂志，2014（09），1011-1030.

[5]邵洁.儿童维生素D、钙营养与骨健康儿童维生素D、钙营养与营养性维生素D缺乏性佝偻病判定与评价现状[J].中国实用儿科杂志，2012（03），161-165.

[6]GB 28050-2011食品安全国家标准预包装食品营养标签通则[S].

[7]GB 10769-2010食品安全国家标准婴幼儿谷类辅助食品[S].

[8]GB 22570-2014食品安全国家标准辅食营养补充品[S].

[9]GB 10765-2010食品安全国家标准婴儿配方食品[S].

[10]GB/T 5009.82-2003食品中维生素A和维生素E的测定[S].

[11]GB/T 5413.9-2010食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中维生素A、D、E的测定[S].

[12]谢云峰，王浩，刘佟，等.在线固相萃取-高效液相色谱联用测定动物源食品中的维生素A、E[J].分析化学，2014（9），1343-1347.

[13]MATAVELI L R V，ARRUDA M A Z.Expanding resolution of metalloprotein separations from soybean seeds using 2D-HPLC-ICP-MS and SDS-PAGE as a third dimension[J].Journal of Proteomics，2014，104，94-103.

[14]CHITTA R，GINZBURG A，DOREMAELE G V.Separating ethylene-propylene-diene terpolymers according to the content of diene by HT-HPLC and HT 2D-LC[J].Polymer.2011，52（26），5953-5960.

[15]PODGÓ RSKA I P，ZÍDKOVÁJ，FLODROVÁ D，et al.2D-HPLC and MALDI-TOF/TOF analysis of barley proteins glycated during brewing[J].JournalofChromatography B，2010，878（30），3143-3148.

[16]丁坤，吴大朋，关亚风.二维液相色谱接口技术[J].色谱，2010，28（12），1117-1122.

[17]萧伟斌，蹇阳，李桦.二维液相色谱在药物和毒物分析中的应用进展[J].分析化学，2014，42（12），1851-1858.

[18]俞安.维生素A的稳定性研究[D].浙江大学，2012.

Simultaneous determination of Vitamin A，α-Tocopherol and Vitamin D3in in⁃fant milk powder with two-dimensional high performance liquid chromatography

CEN Jianbin，OU Shuojun，ZHOU Langjun，LI Xiuying
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Centre for Quality Supervison and Testing of Processed Food（Guangzhou），Guangzhou Guangdong 511447,China）

A method of two-dimensional high performance liquid chromatography（2D-HPLC）have been created for the determination of fat-soluble vitamins（Vitamin A，Vitamin E and Vitamin D3）in infant milk powder.The samples were saponified and extracted with petroleum ether successively.The extract was blew with nitrogen until dried and dissolved with n-hexane to a constant volume.The ten-way valve was switched after Vitamin A and Vitamin E were separated at the amino column，which Vitamin D3can be separated at the Silica gel column.Both columns were coupled with a diode-array detector respectively.The methodology results showed that three fat-soluble vitamins exhibited a good linear relationship in the certain range（Linear Regression Coefficient：0.9963～0.9993）.The recoveries were in the range of 86.7%～99.6%and RSD（n=6）was ranged from 2.07%to 4.11%.The method is simple，high sensitivity and good reproducibility，which is suitable for routine testing of Vitamin A，Vitamin E and Vitamin D3in the infant milk powder.

Ten-way valve；2D-HPLC；simultaneous determination；fat-soluble vitamins

TS252.7

A

1001-2230（2017）02-0043-04

2016-09-21

岑建斌（1989-），男，学士，主要从事食品的检测和研究工作。