降胆固醇植物乳杆菌I4菌在酸奶中的应用

(西华大学生物工程学院，成都610039)

降胆固醇植物乳杆菌I4菌在酸奶中的应用

朱奇奇，张驰翔，王周，蒲博，焦士蓉

(西华大学生物工程学院，成都610039)

由于降胆固醇植物乳杆菌I4菌具有良好的功能特性，为了更好地发挥其益生作用，对I4菌与商业酸奶益生菌进行复配，利用响应面对复配参数进行优化，并对酸奶21 d内的微生物含量、理化指标和降胆固醇率进行测定。结果表明：以商业益生菌与I4菌粉比例为1∶1，发酵时间10.6 h，发酵温度40.9℃，蔗糖质量分数8.1%，后发酵时间16 h进行发酵，酸奶感官评分最高。4℃冷藏21 d间乳酸菌数为4.01×109～4.45×109mL-1，pH值为4～4.28、滴定酸度为72～88oT，持水力为73.3%～80%、乳清析出率为2.1%～8.3%，黏度为407～434 mPa·s，硬度为129.96～221.34 g。通过对复配后发酵的酸奶进行降胆固醇能力的测试，得出胆固醇降解率为43.6%±0.82%。

降胆固醇植物乳杆菌；酸奶；响应面优化；

0 引言

发酵乳制品是益生菌最重要的载体之一，益生菌作为附属发酵剂添加到发酵乳制品中，不仅可以增加发酵乳制品的保健功效，而且还可以改善其品质，赋予其独特的风味[1]。作为食物的添加剂，益生菌还能够增强食品的健康特性，提高产品的消费价值。目前投入市场的益生菌发酵乳制品种类很多，其中包括：含益生菌的酸牛奶、酸乳酪、酸豆奶以及含多种益生菌的口服液、片剂、胶囊、粉末剂等[2]。

本研究试验菌株L.plantarum I4由四川泡菜中分离得到，经研究表明该菌株具有良好的耐酸性及胆盐耐受性，对免疫系统具有显著的调节功能[3]；经体外试验表明，该菌株具有较好的抗氧化作用及降胆固醇功效[12]。因此，本章研究的目的在于通过与商业用酸奶益生菌进行复配，并对乳中发酵特性进行评价，为进一步开发益生菌发酵剂奠定基础。

1 实验

1.1材料与仪器

降胆固醇植物乳杆菌I4菌，新希望纯牛奶，蔗糖，益生优酸奶益生菌，邻苯二甲醛，胆固醇。

电热恒温隔水式培养箱，UV-2600型紫外可见分光光度计，PEN3电子鼻，NDJ-5S旋转黏度计，TA-XT plus质构仪。

1.2方法

1.2.1 酸奶的发酵工艺

纯牛奶→添加白砂糖→接种→混合均匀→发酵→冷藏后熟（4℃）→发酵乳→检验分析

1.2.2 响应面优化实验设计

通过单因素实验（未发表），探讨各因素在酸奶口感的影响大小。以感官评定指标为响应值，选发发酵时间、发酵温度以及蔗糖浓度这3个作用最显著的因素，在发酵粉与I4菌粉比例为1∶1、后发酵时间16 h的条件下。设计Box-Behnken实验。采用Design Expert8.05 b软件辅助实验，实验因素水平及编码值如表1所示。

表1 Box-Behnken设计实验因素水平及编码

1.2.3 感官指标评定

由本实验室成员成立一个15人感官评定小组，经过对酸奶感官评定课程的培训，基本掌握酸奶的感官分析方法。评分标准采用百分制。对酸奶样品的芳香味、气味、口感、表观以及黏稠度进行打分，评定标准如表2所示[4]。

表2 酸奶感官评分

1.2.4 酸奶样品的微生物及理化测定

利用单因素试验优化的工艺参数生产酸奶,发酵结束后在贮藏温度为4℃的条件下贮藏。分别在酸奶样品冷藏期的第1，7，14，21 d取样，进行微生物和理化指标的测定。

⑴微生物指标测定。采用GB 478935-2010的方法测定乳酸菌的菌落数。

⑵理化指标测定。

①pH测定采用PHS-3C型精密pH计测定样品的pH值。

②滴定酸度的测定根据国标GB 541334-2010测定。

③持水力的测定。菌株持水能力采用KEOGH[6]等研究方法，并略作改动。取发酵乳样品5.0 g，离心（3 000 g，10 min）。收集上清液称重。按下列公式计算酸奶的持水性：

持水能力（%）=（沉淀重g/样品重量g）×100%

④自发乳清析出情况。酸奶自4℃冰箱取出后，称酸奶质量（W1），而后将酸奶杯倾斜45°，10 s内吸出表面的乳清，再称取酸奶的质量（W2）。酸奶杯与膜质量记为（W0）。

自发乳清析出=(W1-W2)/(W1-W0)

⑤凝胶强度和黏度的测定。将酸奶样品于室温(25℃)下回复一段时间，选用锥形探头36 R，下压模式，穿入未经搅拌的酸奶，插入深度15 mm，下降速度与测试速度为1.0 mm/s，提升速度为2.0 mm/s，测试深度15.0 mm，记录探入过程中所需的应力（g）[7]。此过程所需最大的力即为酸奶的凝胶强度[8]，每个样品重复测定3次，取平均值。

将酸奶样品于室温(25℃)下回复一段时间，用玻璃棒顺时针、逆时针各搅拌20下，使酸奶样品均匀，选用LV3转子，转速60 r/min，测试时间1 min，每隔5 s取一个测试值，测定搅拌后的酸奶黏度。

发酵酸奶降胆固醇能力的测定参考文献[9-12]。

2 结果与分析

2.1响应面实验结果及分析

选取对酸奶感官质量影响较大的发酵时间、发酵温度以及蔗糖浓度这3个因素做Box-Behnken设计，并且以感官质量评分作为响应值，设计及结果如表3所示。

表3 Box-Behnken设计及结果

利用Design Expert 8.05 b软件对上述数据进行分析，得回归模型方差分析，结果如表4所示。

对表4回归模型方差分析，实验所选用模型P值＜0.0001，极显著，说明不同因子与响应值之间的线性关系是极显著的，同时试验方法也是可靠的。失拟项P值为0.146，不显著(P＞0.05)，说明该方程对实验拟合情况好，可用该方法对各因素条件下的酸奶感官进行预测。本研究R2=0.9771，即响应值有97.71%来源于所选变量的变化，也即该方程拟合度好。变异系数为2.78，说明实验可靠性良好

表4 回归模型方差分析

三个因子经过拟合，得到二次多项回归方程为

R=86.40+6.50A+3.50B+0.50C+0.50AB-0.50AC+ 0.50BC-11.45A2-4.45B2-6.45C2。

根据回归方程作出不同因子的响应面分析图，如图1～图3所示。

图1 发酵时间和发酵温度对酸奶感官评分的影响

图1为在蔗糖质量分数为8%时，发酵时间和发酵温度对酸奶感官评分的交互影响效应。由图1可以看出，发酵温度对酸奶感官评分影响较小，表现为曲线较平滑，而发酵时间的影响则较大，表现为曲线较为陡峭。发酵时间的等高线较密，说明发酵时间与发酵温度对酸奶感官评分的交互效应比较显著。

图2 发酵时间和蔗糖浓度对酸奶感官评分的影响

图2为发酵温度40℃时，发酵时间与蔗糖质量分数对酸奶感官评分的交互影响。由图2可以看出，发酵时间对酸奶感官评分影响较大，表现为曲线较陡峭，同时也可看到，这两者的交互影响较为显著。

图3 发酵温度和蔗糖质量分数对酸奶感官评分的影响

图3为发酵时间10 h的情况下，发酵温度与蔗糖质量分数对酸奶感官评分的交互影响。由图3可以看出，说明发酵温度对酸奶感官评分影响较大，表现为曲线较陡峭。这两者的交互影响较为显著。同时，这也与图2的结论一致。发酵温度和蔗糖质量分数对酸奶感官评分的影响比较，发酵温度影响较为显著，等高线更接近发酵温度。

2.2最佳工艺的预测和验证

通过辅助软件Design Expert，优化发酵条件。得到理论最佳发酵条件和响应数据为，发酵时间10.6 h，发酵温度40.9℃，蔗糖质量分数8.1%。进行验证实验，得到实验结果为89。根据回归方程，计算得其感官评分预测值为88.0532。相对误差为1.1%（小于10%）。证明响应面优化酸奶工艺是可行的。

2.3微生物指标

酸奶样品在1，7，14，21 d活菌数检测结果如表5所示。

表5 不同天数活菌数检测结果 mL-1

由表5可知，经4℃冷藏，乳酸菌的活菌数随着冷藏时间的延长先增加后降低，在7 d时达到最大为4.45×109cfu mL-1，随后开始降低，21 d时为 4.01× 109cfu mL-1。远高于GB 19302-2010要求的乳酸菌数大于等于1×106cfu mL-1，表明乳酸菌在酸乳冷藏期间的存活能力较强。本研究中所选用的植物乳杆菌I4菌按1∶1的添加量与商业发酵剂益生优酸奶益生菌复配制备的酸奶在4℃冷藏21 d后，其活菌数达到了4.01×109cfu mL-1，符合GB 19302-2010要求。

2.4理化指标

2.4.1 pH值与滴定酸度

由图4可以看出，4℃冷藏21 d期间，两样品的pH值随天数的增加呈下降趋势，而滴定酸度呈上升趋势。添加了L.plantarum I4的酸奶样品中，其pH值和滴定酸度与样品相比在各个阶段差异均不显著(P＞0.05)，这可能是由于L.plantarum I4在乳中产酸能力较差的原因，进而表明添加L.plantarum I4对酸奶冷藏期间的pH值与滴定酸度没有太大影响，而滴定酸度滴定酸度大于70并呈上升趋势。符合国标GB 19302-2010。

图4 冷藏期间pH值、滴定酸度变化情况

2.4.2 持水力变化

持水力是酸奶的重要理化指标之一，它的大小直接影响着酸奶的组织状态。酸奶样品持水性越好，酸乳凝胶体系中束缚水的含量就越多，在不破乳的情况下更能保持产品较好的风味和气味，使产品口感更佳。酸奶的持水力变化如图5所示。

图5 冷藏期间持水率变化情况

由图5可以看出，酸奶样品在冷藏期间都表现出了很好的持水力。由图5可知，两组酸奶样品在冷藏期间都表现出了很好的持水力，含有L.plantarum I4酸奶样品的持水能力略低于商业发酵剂样品，但差异不显著（P＞0.05）。

2.4.3 自发乳清变化、硬度和黏度的变化

由图6～图8可以看出，L.plantarum I4对酸奶样品的凝胶强度和黏度无显著影响。添加了L.plantarum I4的样品的凝胶强度略高于商业发酵剂的样品，黏度略低于商业发酵剂的样品，但差异均不显著(P＞0.05)，两组样品均在冷藏7 d时凝胶强度达到最大值，在7 d后硬度呈下降趋势。样品的黏度和乳清析出率在1～14 d冷藏期呈上升趋势，在14 d后黏度最大，乳清析出率基本不变，到21 d时黏度稍微下降，可能是因为冷藏至21 d时，酸奶的自发乳清析出比较多，导致黏度下降。

图6 冷藏期间自发乳清析出变化情况

图7 冷藏期间酸奶硬度的变化情况

2.5酸奶降胆固醇能力测定

图8 冷藏期间酸奶黏度变化情况

通过对酸奶中降胆固醇能力的测试，得出复配优化后酸奶对胆固醇降解率为43.6%±0.82%（n=3），商业用益生优酸奶益生菌发酵酸奶对胆固醇降解率为14.3%±0.9%（n=3），说明通过复配优化后做益生性发酵酸奶中具有显著的降胆固醇效果。

3 结论

（1）通过Box-Behnken响应曲面法实验，确定了益生性酸奶的的最佳试验条件为：优化发酵条件得到理论的最佳的发酵条件和响应数据为，发酵粉与I4菌粉比例为1∶1，发酵时间10.6 h，发酵温度40.9℃，蔗糖质量分数8.1%，后发酵时间16 h。

（2）对响应面优化后的益生性酸奶进行微生物测定，经4℃冷藏，乳酸菌数21 d内为4.01×109～4.45× 109mL-1，符合GB 19302-2010要求。

（4）对响应面优化后的益生性酸奶进行理化测定，4℃冷藏21 d期间，酸奶的pH值随天数的增加呈下降趋势，而滴定酸度滴定酸度大于70并呈上升趋势。符合国标GB 19302-2010。4℃冷藏21 d期间持水力为73.3%～80%，乳清析出率为2.1%～8.3%，黏度为407～434 mPa·s和硬度为129.96～221.34 g。表明L. plantarum I4对酸奶样品的滴定酸度、凝胶强度、持水力等均无不良影响（P＞0.05），所以将其作为附属菌应用到酸奶生产中具有极大的可行性。

（4）通过对酸奶中降胆固醇能力的测试，得出复配优化后酸奶对胆固醇降解率为43.6%±0.82%（n=3），商业用益生优酸奶益生菌发酵酸奶对胆固醇降解率为14.3%±0.9%（n=3），说明通过复配优化后做益生性发酵酸奶中具有显著的降胆固醇效果。

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Study on the application of I4 cholesterol-lowering plant Lactobacillus bacteria in yogurt

ZHU Qiqi,ZHANG Chixiang,WANG Zhou,PU Bo,JIAO Shirong
（School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China）

I4 cholesterol-lowering plant Lactobacillus bacteria has good functional properties,in order to better play a role of prebiotics,to compound with I4 bacteria and commercial probiotic bacteria of yogurt,Using response surface methodology to optimal the composited parameters.We also measured the microbial content,physical and chemical index and the rate of cholesterol-lowering of yogurt within 21 days. The result shows that the optimal sensory properties of fermentation yogurt with commercial probiotics bacteria and I4 bacteria ratio of 1∶1, fermentation time 10.6 h,fermentation temperature 40.9℃,sucrose concentration 8.1%,after fermentation 16 h.4℃ refrigerated within 21 days，the number of Lactic acid bacteria is 4.01×109～4.45×109mL-1,pH is 4～4.28,titratable acidity is 72～88oT,water-holding power is 73.3%～80%,whey separation rate is 2.1%～8.3%,viscosity is 407～434 mPa·s,hardness is 129.96～221.34 g.The test of the cholesterol-lowering ability of fermented yogurt of optimal composited parameters indicates rate of 43.6%±0.82%.

cholesterol-lowering plant Lactobacillus;yogurt;response surface methodology

TS252.1；TS252.54

A

1001-2230（2017）02-0012-05

2016-09-13

西华大学省级重点试验室开放研究基金项目（szjj2014-009)；教育部春晖计划（12205543）；西华大学研究生创新基金资助（ycjj2015025)。

朱奇奇(1990-)，男，硕士研究生，研究方向为食品领域。

焦士蓉