七叶胆苷ⅩⅤⅡ大鼠体内药代动力学研究

王超+顾冬冬+王彦+韩雪春

[摘要] 应用高效液相色谱-质谱联用分析方法，建立七叶胆苷ⅩⅤⅡ体内分析方法，方法学结果显示线性范围为1～2 500 μg·L-1（r=0.996 3）；高、中、低3种不同浓度的日内RSD分别为9.9%，3.0%，1.7%；日间RSD分别为16%，14%，2.5%；基质效应90.0%～100%，RSD<15%；回收率>80.0%。对大鼠静脉和灌胃给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ对照品后测定血浆中浓度随时间的动态变化过程，绘制药时曲线，并根据药时曲线计算药代动力学参数。用DAS 2.0软件计算得到七叶胆苷ⅩⅤⅡ在大鼠体内口服药代动力学参数tmax为0.17～0.20 h，t1/2为1.94～2.56 h，生物利用度为1.87%。结果显示七叶胆苷ⅩⅤⅡ药动学特征为口服吸收分布快，达峰时间快，消除快。

[关键词] 七叶胆苷ⅩⅤⅡ； 药代动力学； LC-MS/MS； 血药浓度

[Abstract] In this study， we established an HPLC-MS method to determine gypenoside ⅩⅤⅡ in biosamples. The methodology results indicated that the linear range was 1-2 500 μg·L-1（r=0.996 3）； intraday RSD values for high， medium and low concentrations were 9.9%， 3.0% 1.7%； interday RSD values were 16%， 14%， 2.5%； matrix effect ranged between 90.0%-100%， with RSD<15%. The recovery was more than 80.0%， with precision and accuracy in line with request. After the rats were orally and intravenously administered with gypenoside ⅩⅤⅡ， the concentrations of gypenoside ⅩⅤⅡ in plasma were determined， and pharmacokinetic parameter was calculated using pharmacokinetic software DAS 2.0. According to the main pharmacokinetic parameters of gypenoside ⅩⅤⅡ， tmax was 0.17-0.20 h， t1/2 was 1.94-2.56 h， bioavailability of oral administration was 1.87%. The results indicated that the pharmacokinetic profiles of gypenoside ⅩⅤⅡ were rapid absorption and distribution after oral administration， short time to peak and rapid elimination.

[Key words] pypenoside ⅩⅤⅡ； pharmacokinetics； LC-MS/MS； plasma concentration

三七Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen為五加科人参属植物，又名田七、金不换等，为我国名贵中药材，产于云南和广西[1]。三七具有活血化瘀、消肿止痛和滋补强壮等功效[2]，主要化学成分为皂苷、黄酮、多炔醇、多糖、氨基酸、肽以及脂肪酸等，其中三萜皂苷类成分是三七制剂的主要有效成分和质控指标[3]。目前对于皂苷的研究大多数集中于三七药材中含量较高的三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd等[4-5]。

现代药理学研究表明，三七中含有的一些微量皂苷成分也具有很显著的药理活性。七叶胆苷在体内具有抗肿瘤活性，其可能机制为代谢生成了具有诱导肿瘤细胞凋亡作用的20-O-（β-吡喃葡萄糖基）-20（S）-原人参二醇[6]。据报道，从三七中发现的一种新的植物雌激素七叶胆苷ⅩⅤⅡ属于七叶胆苷类化合物，通过抑制氧化应激，抑制脑缺血导致的神经损伤，进而抑制氧化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，其作用机制可能与抑制免疫炎症因子的分泌和自由基清除作用有关，从而起到防止动脉粥样硬化的作用[7]。为了更好地理解七叶胆苷ⅩⅤⅡ的作用机理、作用过程，有必要全面了解其体内动态变化规律。本研究监测七叶胆苷ⅩⅤⅡ大鼠体内血药浓度变化规律，为后期药物安全性评价、临床新药研究提供科学依据。

1 材料

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪，Thermo TSQ Vantage，ESI 离子源，XS105 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Legend Micro17 微量台式离心机（美国Thermo Finnigan 公司）；Vortex Genie-2 涡旋振荡器（美国Scientific 公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声波清洗器）。

七叶胆苷ⅩⅤⅡ对照品（批号130421，纯度>98%）和内标人参皂苷Rg1（批号140809，纯度>95%）购自上海同田生物技术股份有限公司；甲酸（分析纯，中国国药控股有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）。

雄性/雌性Wistar大鼠，体重（200±20） g，购自北京维通利华有限公司。普通饲料喂养，自由饮水进食，适应性喂养1周。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温 45 ℃；流动相水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，0～2 min，10%～50%B，2～3.5 min，50%～90%B，3.5～6 min，90%B，6～6.5 min，90%～10%B，流速0.4 mL·min-1；进样体积10 μL。

质谱参数：Thermo TSQ Vantage三重四级串联质谱仪；ESI离子源；负离子检测模式；离子源参数设置：喷雾电压（spray voltage）3.0 kV；喷雾温度（vaporizer temperature）200 ℃；鞘气流速（sheath gas）40 unit；辅助气流速（aux gas）10 unit；毛细管温度（capillary temperature） 300 ℃；碰撞气（collision gas， argon）1.5 mTorr；质谱扫描模式选择反应监测（SRM）：七叶胆苷ⅩⅤⅡ m/z 945.5/783.8，CE 31 eV；GRg1 m/z 799.5/637.6，CE 24 eV。所有操作以及数据处理由Xcalibur（version 2.2）软件控制。

2.2 给药方案与血样采集

2.2.1 尾静脉给药

12只SD大鼠，实验前禁食12 h，实验期间自由饮水。以2 mg·kg-1经尾静脉注射给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ溶液，于给药后5，10，20，40，60，120，180，240，360，480，720 min经眼球后静脉丛采血 0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r·min-1离心 10 min，吸取上层血浆，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.2.2 口服给药

12只SD大鼠，实验前禁食12 h，实验期间自由饮水。以50 mg·kg-1（2.0 mL·kg-1）的剂量口服给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ溶液，于给药后5，10，20，40，60，90，120，180，240，360，480，720 min经眼球后静脉丛采血0.2 mL，置于涂有肝素的Eppendorf管中，4 000 r·min-1离心 10 min，吸取上层血浆，置于-20 ℃冰箱中保存，待分析。

2.3 血浆样品预处理

取大鼠血浆样品50 μL，加入内标溶液50 μL，甲醇150 μL，涡旋混合30 s，15 000×g离心10 min，吸取上清液10 μL，进样分析，记录色谱图。此外，由于静注给药后5 min血药浓度超过了仪器的定量上限。因此，将该时间点得到的血浆样品用空白血浆稀释1倍后再按照上述处理方法处理。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

取大鼠空白血浆，除不加内标溶液并补加相应体积的甲醇外，其余按2.3项下操作，获得空白血浆样品色谱图；另取50 μL质量浓度为500 μg·L-1的七叶胆苷ⅩⅤⅡ对照溶液，37 ℃氮气吹干后，加入50 μL空白血浆涡旋混合均匀，其余按2.3项下操作，获得模拟生物样品色谱图；再取静注给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ（2.0 mL·kg-1）后60 min血浆样品，按2.3项下操作，获得给药血浆样品色谱图。

2.4.2 线性关系、检测限与定量限试验

精密移取各标准系列溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后，加入50 μL空白血浆涡旋混合均匀配制成相当于1，5，10，50，100，500，1 000，2 500 μg·L-1的七叶胆苷ⅩⅤⅡ标准系列溶液，其余按2.3项下操作。以七叶胆苷ⅩⅤⅡ浓度为横坐标（C），七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积比值为纵坐标（R），以加权（1/x2）最小二乘法进行线性回归运算，得回归方程即为标准曲线。

2.4.3 精密度和准确度试验

按标准曲线配制方法制备含七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度分别为5，50，2 000 μg·L-1的质量控制 （QC）样品，每个浓度平行配制5份。取空白血浆50 μL，按2.3项下操作，连续测定3 d，记录色谱图，计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ峰面积As和内标峰面积Ai的比值fx，代入当天的标准曲线求得实测浓度及實测浓度准确度，计算日内和日间精密度，与配制浓度相比，求得方法的准确度。

2.4.4 提取回收率试验

精密移取各QC标准溶液50 μL置1.5 mL离心管中，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL，涡旋混合均匀后加入200 μL甲醇沉淀蛋白，涡旋混合30 s，15 000×g离心10 min，分取上层清液150 μL，加入内标50 μL，涡旋混合均匀后，吸取10 μL进样分析，记录色谱图，每一浓度平行配制5份，计算各浓度样品和内标的峰面积比值A。

另取空白血浆50 μL，加入甲醇200 μL沉淀蛋白，涡旋混合30 s，15 000×g离心10 min，分取上层清液，得空白血浆上清液。另取各标准溶液50 μL，置1.5 mL离心管中，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆上层清液250 μL，涡旋混合均匀后，吸取150 μL加入50 μL内标溶液，涡旋混合均匀后吸取10 μL进样分析，记录色谱图，每一浓度平行配制5份，计算各浓度样品和内标的峰面积比值B。A与B的比值即为七叶胆苷ⅩⅤⅡ的提取回收率。

2.4.5 稳定性试验

2.4.5.1 短期稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg·L-1的QC样品，在室温下放置24 h后按2.3项下操作，每一浓度5个样品，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算实测浓度与制备浓度的比值从而求得样品短期稳定性。若比值为85.0%～115%，则认为样本稳定。

2.4.5.2 长期稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg·L-1的QC样品，在-20 ℃冰箱中放置14 d后按2.3项下操作，每一浓度5个样品，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算所测浓度与制备浓度的比值从而求得样品的长期稳定性。若比值在85.0%～115%，则认为样本稳定。

2.4.5.3 冻融稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg·L-1的QC样品，置-20 ℃冰箱储存24 h，取出解冻后再置于-20 ℃储存24 h，取出，解冻，再置-20 ℃储存24 h取出解冻后进样分析，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算所测浓度与制备浓度的比值从而求得样品的冻融稳定性。若比值在85.0%～115%，则可认为样本稳定。

2.4.5.4 样品在进样器中稳定性 精密移取各标准溶液50 μL，37 ℃氮气吹干后加入空白血浆50 μL。配制成相当于七叶胆苷ⅩⅤⅡ质量浓度为5，50，2 000 μg·L-1的QC样品，按2.3项下操作，在自动进样器中放置8 h后进样分析，每一浓度5个样品，记录相应的色谱图。将七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积的比值带入随行标曲中计算七叶胆苷ⅩⅤⅡ的实测浓度，计算所测浓度与制备浓度的比值从而求得样品在进样器中的稳定性。若比值在85.0%～115%，则可认为样本稳定。

2.5 基质效应

取空白血浆，按2.3项下操作制备空白血浆上清液适量，备用。精密移取100 μL质量浓度为5，50，2 000 μg·L-1标准溶液于1.5 mL离心管中，以氮气流吹干。残渣以空白血浆上清液100 μL复溶，15 000×g离心10 min，分取上层清液，进行LC-MS分析。记录色谱图，记录七叶胆苷ⅩⅤⅡ峰面积A。

精密移取100 μL质量浓度为5，50，2 000 μg·L-1的标准溶液于1.5 mL离心管中，以氮气流吹干。残渣以蒸馏水100 μL复溶，15 000×g离心10 min，分取上层清液，进行LC-MS分析。记录色谱图和七叶胆苷ⅩⅤⅡ峰面积B，计算基质效应（matrix effect，ME）。ME=A/B×100%。若ME在85.0%～115%，则可认为没有基质效应。

2.6 药动学研究

实验资料采用中国药理学会编写的药代动力学统计软件包DAS 2.0进行非房室模型拟合，计算口服给药的生物利用度（bioavailability，BA）。BA=（AUCpo × Dose iv）/（AUCiv × Dosepo）×100%。

3 结果

3.1 色谱、质谱条件优化

对七叶胆苷ⅩⅤⅡ和内标Rg1进行质谱全扫模式研究。在负离子模式下，七叶胆苷ⅩⅤⅡ能够产生m/z 915.98[M-H]-，对其进行二级质谱分析，其主要碎片为m/z 783.87。因此，选择离子对m/z 945.5/783.94为七叶胆苷ⅩⅤⅡ的SRM定量离子对。同样对内标GRg1也进行相关二级能量等参数优化，m/z 799.90/637.64作为GRg1的SRM定量离子对。在色谱条件优化过程中，选择不同流动相进行相关实验，乙腈作为有机相时峰型较好，分析时间较短，最终选择乙腈作为有机相。

3.2 血浆样品处理方法

比较了有机溶剂沉淀蛋白、液-液萃取法和固相萃取法，固相萃取处理的样品能除掉大部分的盐和干扰物质，但萃取小柱价格昂贵，沉淀蛋白处理的样品操作简单，重复性好，成本最低。因此从经济角度考虑选择沉淀蛋白作为样本处理方法。

3.3 分析方法学验证

3.3.1 系统适用性与专属性试验

空白血浆、空白血浆加标准品以及给药后所得血浆色谱图见图1。结果表明，在该色谱条件下，七叶胆苷ⅩⅤⅡ和内标保留时间分别为3.67，2.51 min，血浆中内源性雜质不干扰七叶胆苷ⅩⅤⅡ和内标的测定。

3.3.2 标准曲线与最低定量限

以七叶胆苷ⅩⅤⅡ浓度为横坐标，七叶胆苷ⅩⅤⅡ与内标峰面积比值为纵坐标，以加权最小二乘法进行线性回归运算，得标准曲线方程为R=0.007 07+0.006 11 C，r=0.996 3， weight=1/c/c。标准曲线各个浓度点的准确度在85.0%～115%。结果表明，七叶胆苷ⅩⅤⅡ在1～2 500 μg·L-1线性关系良好。方法检测限（LOD）为0.3 μg·L-1（S/N>3），最低定量限（LLOQ）为1 μg·L-1（S/N>10），表明该方法灵敏度较高，可用于七叶胆苷ⅩⅤⅡ的微量分析。

3.3.3 精密度与准确度

精密度和准确度结果见表1，结果表明，高、中、低3个浓度日内精密度与日间精密度RSD均小于15%，准确度为93.90%～99.41%。

3.3.4 基质效应与提取回收率（绝对回收率）

方法提取回收率结果见表2，结果表明，高、中、低3个浓度提取回收率均符合生物样本的分析要求，且RSD均小于15%，该方法提取回收率较高。基质效应测定结果表明，内源性物质不干扰七叶胆苷ⅩⅤⅡ的测定，ME为90.0%～100%，且RSD小于15%。

3.3.5 样本稳定性

稳定性试验结果表明，七叶胆苷ⅩⅤⅡ在血浆中-20 ℃放置14 d，室温下放置24 h，经过3个冻融

结果表明，所建立的血浆样品分析方法符合有关规定的要求，可以用于七叶胆苷ⅩⅤⅡ体内药代动力学研究。

3.4 藥动学研究

3.4.1 静脉注射给药后七叶胆苷ⅩⅤⅡ在大鼠体内药动学过程

大鼠静脉注射给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ（2 mg·kg-1）后，其体内血药浓度-时间曲线见图2。七叶胆苷ⅩⅤⅡ静脉注射后能够快速从大鼠体内消除，给药后12 h其体内血药浓度基本检测不到（低于LLOQ）。七叶胆苷ⅩⅤⅡ的总体清除率CL为（3.45±1.70） L·kg-1·h-1，其消除半衰期t1/2小于2 h，药动学非房室分析所得药动学参数见表4。

3.4.2 口服给药后七叶胆苷ⅩⅤⅡ在大鼠体内药动学过程

大鼠口服给予七叶胆苷ⅩⅤⅡ后（50 mg·kg-1），其体内血药浓度-时间曲线见图3。

七叶胆苷ⅩⅤⅡ口服给药后能够迅速从胃肠道吸收进入血中，给药后5 min在血中可以检测到七叶胆苷ⅩⅤⅡ，并迅速达到最大血药浓度，达峰时间为0.19 h。口服给药后七叶胆苷ⅩⅤⅡ消除非常快，半衰期较短。口服生物利用度较低，为1.87%，可能是由于其极性大，脂溶性较差，难以透过肠系膜所致。非房室模型分析所得药动学参数见表5。七叶胆苷ⅩⅤⅡ无论静注还是口服，其体内滞留时间均较短，消除较快，半衰期约为2 h，属于短半衰期类药物。同时，体内药动学行为基本不存在性别差异；t1/2，MRT，CL等主要药动学参数无显著性差异。有文献报道[8-9]，原人参二醇型皂苷三七皂苷Fc，人参皂苷Rb1等都属于长半衰期（t1/2>20 h）的化合物，这表明皂苷类化合物半衰期可能与皂苷结构中糖的种类、取代的位点以及糖的数目都有一定关系。

4 结论

本研究建立了测定大鼠血浆中七叶胆苷ⅩⅤⅡ的LC-MS/MS方法，该方法简单、灵敏、快捷，精密度等线性关系良好，可以用于生物样本中七叶胆苷ⅩⅤⅡ的药代动力学研究。这为理解七叶胆苷ⅩⅤⅡ的作用机制、作用过程奠定了基础，为后期药物安全性评价、临床新药研究提供了科学依据。

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