关于杜仲3类有效成分检测中应用多波长高效液相色谱法测定的结果分析

陈转艮+丁少波+梁淑贞+陈润添

【摘要】 目的 研究采用多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果。方法 采用Dionex C18柱以及流动相组成一种甲醇-0.1%磷酸水来进行梯度洗脱操作， 对杜仲中的3类有效成分进行测定， 分析测定结果。结果 进行色谱峰分离的效果较好， 多波长高效液相色谱法能够对杜仲中的桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸以及京尼平苷酸进行同时测定， 其中桃叶珊瑚苷的含量为0.67%， 松脂醇二葡萄糖苷的含量为0.45%， 绿原酸的含量为3.16%， 京尼平苷酸的含量为1.12%。结论 多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果显著， 操作简单， 具有较好的重现性， 能够为杜仲内在质量的控制提供科学有效的依据。

【关键词】 多波长高效液相色谱法；杜仲；有效成分

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.01.096

杜仲属于一种名贵的中药材， 具有利尿、安胎、坚筋骨以及降血压等诸多功效[1]。该药物的主要化学成分包括杜仲胶、多糖、黄酮、苯丙素类、环烯醚萜类以及木脂素类等。部分学者对杜仲中的桃叶珊瑚苷、绿原酸、松脂醇二葡萄糖苷以及京尼平苷酸等进行了测定， 这4种物质属于杜仲的主要药效成分， 可以将其概括为3大类， 在测定上具有较大的难度[2-6]。本研究主要探讨多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果， 总结如下。

1 仪器与试剂

1. 1 仪器 超声波清洗器（频率为25 kHz， 功率为250 W）；FZ102型微型植物试样粉碎机；precisa 分析天平；UltiMate 高效液相色谱仪。

1. 2 试剂 二次蒸馏水；甲醇（色谱纯）；杜仲皮（产地：山东）；京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸对照品。

2 方法

2. 1 制备供试品溶液 称取50 g杜仲药材， 将其研制成为絮状粉末， 取2 g左右的样品粉末， 将其放置在具塞锥形瓶中， 将60 ml 75%的甲醇加入， 对其进行称重， 进行30 min的超声提取， 冷置， 对其进行称重， 将减失的重量补足， 然后再将其滤过， 药渣再重复上述操作一次。进行两次滤液处理之后将其减压浓缩， 并且采用相同浓度的甲醇溶液对其进行定容， 一直到20 ml， 对其进行均匀摇晃， 采用0.45 μm的微孔滤膜对其进行滤过， 最后获得供试品溶液。

2. 2 制备对照品溶液 称取适量的京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸对照品， 将其放置在容量瓶中（10 ml）， 将色谱纯甲醇加入到其中， 将其溶解， 并将其稀释到刻度， 对其进行摇晃， 将其制备成为对照品混合储备液， 具体的浓度：桃叶珊瑚苷为0.70 g/L、松脂醇二葡萄糖苷为0.50 g/L、绿原酸为3.32 g/L、京尼平苷酸为1.20 g/L， 采用冷藏的方式进行保存。

2. 3 色谱具体条件 进样量为10 μl；检测波长分别为320、280、240、210 nm；柱温为25℃；流速为1.0 ml/min；流动相为甲醇-0.1% 磷酸水梯度洗脱；色谱柱为 Dionex C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）。

3 结果与分析

3. 1 优化提取条件 提取方法采用回流法与超声法， 根据已经拟定好的色谱条件， 分别采用两种提取方式对提取的样品进行测定， 将4种有效成分的峰面积之和作为考察的具体指标， 结果显示出两种提取方法不具备较大的差异性， 但是超声提取这种方式具有快捷、简单等优点， 所以最终选用超声提取法对样品进行提取。

3. 2 优化超声提取条件 称取2 g杜仲药品， 一共有9份， 对超声提取杜仲中主要活性成分提取时间、提取次数、料液比以及溶解浓度等影响因素进行 L9（34）正交试验[7-10]， 结果显示最好的提取方案為：料液比1 g/30 ml、75%甲醇、进行3次超声提取， 将每次提取的时间控制在30 min。其次， 结果显示料液比对杜仲中主要成分的提取影响最大， 其次为提取次数、甲醇浓度、反应时间。

3. 3 优化色谱条件 检测波长的选择：对样品采用PDA-3000光电二极管进行全波长扫描， 为了能够达到干扰小、吸收强的目的， 对京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸各物质的光谱性质差异进行利用， 将3D-plot图谱作为依据， 最终决定采用四波长进行检测[11-13]， 具体为：320 nm测定绿原酸、280 nm测定松脂醇二葡萄苷、240 nm测定京尼平苷酸、210 nm测定桃叶珊瑚苷。在这种条件下， 能够获得最多的图谱信息量， 并且具有较好的峰形， 基线平稳， 溶剂受到的干扰少， 能够对各种物质进行准确的分析。

优化流动相：对甲醇-乙腈、乙腈-水、甲醇-水分别进行梯度洗脱比较， 结果显示， 在甲醇-水位流动相时， 分离较好， 出峰较多， 但是会有拖尾现象出现， 所以将磷酸快加入到流动相中， 以此来达到消除拖尾的目的。结果显示， 甲醇-0.1%磷酸水梯度洗脱时， 能够获得理想的色谱峰分离度以及峰形， 具有较好的程序稳定性。

3. 4 方法学考证 线性关系考察：采用流动相溶液将对照品储备液稀释， 并且配备成为对照品系列溶液， 桃叶珊瑚苷：0.08、0.17、0.35、0.70、1.40 g/L；松脂醇二葡萄糖苷：0.06、0.12、0.25、0.50、1.0 g/L；绿原酸：0.42、0.83、1.66、3.32、6.64 g/L；京尼平苷酸：0.15、0.30、0.60、1.20、2.40 g/L。分别进样5 μl， 对其进行55次平行测定， 结果显示， 京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、松脂醇二葡萄糖苷、绿原酸的峰面积和其进样浓度具有良好的线性关系。

方法的稳定性、重复性以及回收率分析：选取相同批次的5份供试品， 采用供试品溶液制备以及检测方法对其进行测定， 对其重复性的RSD进行计算， 结果显示， 在24 h内， 试品溶液具有较好的稳定性， 并且实验的重复性好。

3. 5 杜仲样品测定 取约2 g的杜仲样品粉末， 对其进行精密称定， 放置在具塞锥形瓶中， 采用优化后的提取方案提取样品， 并且在最优色谱条件下对其进行测定， 结果分别在320、280、240、210 nm的波长条件下进行检测， 最终结果显示， 桃叶珊瑚苷的含量为0.67%， 松脂醇二葡萄糖苷为0.45%， 绿原酸为3.16%， 京尼平苷酸为1.12%。这种波长能够对各种化合物的含量进行准确的测定。

4 讨论

本研究采用多波长高效液相色谱法对杜仲3类有效成分进行测定， 可以在相同的色谱条件下采用不同波长对其进行检测， 能够有效实现同时定量测定多个成分、多类组分的目的， 不仅在很大程度上提高了检测效率， 而且其精密度与准确度能够与要求相符合。与此同时， 进行方法学考察、色谱条件优化以及提取条件优化之后， 对提取条件进行了最终确定[14， 15]。最后， 实验对样品中4种成分的含量采用多波长同时检测的方式进行了测定， 具有较高的可靠性与精确性。

综上所述， 多波长高效液相色谱法测定杜仲3类有效成分的效果显著， 操作简单， 具有较好的重现性， 能够为杜仲内在质量的控制提供科学有效的依据。

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