越鞠保和丸联合辛伐他汀对动脉粥样硬化小鼠心肌纤维化的作用＊

李玉波，郝改梅，梁 媛，王国为，贾海骅，李志更

（中国中医科学院中医基础理论研究所 北京 100700）

许多中医学者认为早期高脂饮食可导致高脂血症，病位在肝胆脾，日久而见湿、痰、瘀、热、食郁从而形成动脉粥样硬化[1,4]。现在医学研究发现[5,6]，在动脉粥样硬化的过程中，存在心肌纤维化等心肌病变。越鞠丸是治疗六郁的代表方，保和丸能和胃消食，他汀类药物能一定程度逆转心肌纤维化[7,8]，因此本文旨在探讨越鞠保和丸能否增强他汀类药物对动脉粥样硬化引起的心肌纤维化的逆转作用。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

6周龄SPF级APOE-/-小鼠60只，雄性，体重15-20 g，由北京维通利华生物技术有限公司提供，普通饲料和高脂饲料也由此公司提供。小鼠按照随机数字表法随机分成5组，即正常对照组（N组）、模型对照组（M组）、越鞠保和丸组（YB组）、越鞠保和丸联合辛伐他汀组（YBS组）、辛伐他汀组（S组），每组15只。本试验经过中国中医科学院中医基础理论研究所伦理审查委员会的许可。

1.2 药物剂量及给药方法

越鞠保和丸（中成药，国药准字Z11020510，产品批号16081241）购自中国北京同仁堂（集团）有限责任公司，组成：栀子（姜制）、六神曲（麦麸）、醋香附、川芎、苍术、木香、槟榔；规格：水丸每袋丸重6 g，6 g×10袋；成人（60 kg）用法用量：口服，一次6 g，一日2次。人（60 kg）与小鼠（0.02 kg）间用药剂量折算系数为9.01，按照成人60 kg一次的用药剂量6 g转化为0.02 kg小鼠一次的剂量为0.018 g，用0.2 mL无菌纯净水溶解。

辛伐他汀（舒降之）由杭州默沙东制药有限公司提供，按照成人60 kg一天的用药剂量20 mg转化为0.02 kg小鼠一天的原始剂量为0.06 mg，将20 mg辛伐他汀片剂研磨成粉后用66.66 mL无菌纯净水制成悬浊液。

N组小鼠普通饲料饲养，M组小鼠高脂饲料饲养，两组每日每只灌胃0.4 mL生理盐水；YB组小鼠高脂饲料饲养，每日每只灌胃0.2 mL越鞠保和丸悬浊液和0.2 mL生理盐水混合液；S组小鼠高脂饲料饲养，每日每只灌胃0.2 mL辛伐他汀悬浊液和0.2 mL生理盐水混合液；YBS小鼠高脂饲料饲养，每日每只灌胃0.2 mL越鞠保和丸悬浊液和0.2 mL辛伐他汀悬浊液混合液。

1.3 动脉粥样硬化引起的心肌纤维化模型的确立

高脂饲料饲养M组、YB组、S组和YBS组小鼠20周后，从每组中随机抽取5只小鼠取材，观察其主动脉窦部和头臂干动脉是否有粥样硬化斑块，如果全部都有则认为动脉粥样硬化斑块模型确立，再对心肌组织进行masson染色观察心肌是否有纤维化，如果全部都有则认为心肌纤维化模型确立，根据课题组前期预实验的结果，高脂饲料喂养20周后模型可确立。

1.4 收集血清和心肌组织样本

五组小鼠饲养20周后取材，小鼠经10%水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血1 mL，然后取左心室；血液离心后取血清放入冻存管中置于-80℃冰箱保存，左心室放入4%多聚甲醛中固定保存，血清和心肌组织各40个样本。

1.5 Elisa法检测小鼠血清血脂、AngⅡ、MMP-1含量

血清胆固醇的检测方法主要为化学抽提法—ALBK法和酶法；血清甘油三酯的检测方法主要为酶法，也有二氯甲烷-硅酸-变色酸法和高效液相色谱法；血清低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的检测方法主要为超速离心结合ALBK法，也有酶法。为了使检测结果具有一致性，小鼠血脂四项（血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白）及AngⅡ、MMP-1均采用酶联免疫吸附测定法（Elisa法），Elisa试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。实验加入100 ul终止液，轻轻混匀30 s后30 min内在450 nm处读OD值。以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

1.6 心肌组织masson染色及心肌胶原染色及定量分析胶原容积分数

心肌胶原染色及定量分析胶原容积分数：取左心室心肌组织行Masson及染色，光镜100倍下观察心肌胶原变化，以图像分析系统定量分析胶原容积分数（CVF），其中CVF=胶原面积/全视野面积×100%，每张心肌切片标本均随机取6个视野测量，取平均值。

1.7 高通量转录组测序分析各组心肌组织差异表达基因

由Trizol法提取各组心肌组织RNA，RNA质检、转录组测序及数据分析由北京奥维森基因科技有限公司完成。

1.8 统计分析

统计软件：SPSS17.0；计量资料采用均数±标准差的形式表示；统计方法：随机区组设计方差分析（ANOVA）和最小显著性差异法（LSD），P＜0.05认为有统计学意义。

2 结果

2.1 五组小鼠饲养20周后血清血脂、AngⅡ、MMP-1含量

M组小鼠血清TC、TG、LDL-C、AngⅡ含量明显高于N组，HDL-C、MMP-1含量明显低于N组。S组和YBS组小鼠血清TC、TG、LDL-C、AngⅡ含量较M组有明显降低但仍高于N组，HDL-C、MMP-1含量明显高于M组但仍低于N组。YB组小鼠血清TC、LDL-C、AngⅡ含量较M组有明显降低但仍高于N组，MMP-1含量明显高于M组但仍低于N组，TG与HDL-C含量与M组相比其差异无统计学意义。（见表1）

2.2 心肌胶原染色及定量分析CVF

Masson染色下，心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝绿色。光镜100倍下观察发现：N组心肌细胞之间、血管周围胶原沉积较少；M组、S组、YB组、YBS组心肌间质胶原纤维不同程度的明显增多，排列紊乱，呈粗细不等的条状或网状，与肌束走向平行，部分围绕心肌细胞的胶原纤维网断裂；M组、S组、YB组、YBS组CVF明显高于N组，差异有统计学意义；YBS组CVF明显低于M组、S组、YB组，差异有统计学意义。（见表2、图1）

表1 五组小鼠饲养20周后血清血脂、AngⅡ、MMP-1含量（单位：mmol/L，n=10）

表2 五组小鼠饲养20周后心肌组织Masson染色定量分析CVF

图1 五组小鼠饲养14周后心肌组织Masson染色（A-E分别为N组、M组、S组、YB组、YBS组）

2.3 高通量转录组测序差异基因分析

从2.1和2.2可以看出YBS组在降低血脂和保护心肌方面均优于YB组和S组，因此我们将YBS组和N组、M组进行了高通量转录组测序。转录组测序差异基因数目显示：YBS组较N组有103个基因上调（P＜0.05），37个基因下调（P＜0.05）；YBS组较M组有810个基因上调（P＜0.05），94个基因下调（P＜0.05）；M组较N组有36个基因上调（P＜0.05），490个基因下调（P＜0.05）。转录组测序KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析主要基于五个方面（见表3），结果以散点图的形式显示YBS组和N组、YBS组和M组20条富集最显著的通路（见图2、图3、图4），图2 YBS组和N组差异基因KEGG富集散点图（Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因个数被用来衡量KEGG富集程度。其中Rich factor指pathway中富集到的差异表达基因数量与注释基因数量的比值。Rich factor值越大，说明富集的程度越大。Qvalue(取值范围0-1)是通过多重假设检验校正之后的Pvalue，Qvalue的值越接近于零，说明富集越显著。）

表3 差异基因KEGG富集列表

图2 YBS组和N组、M组转录组测序结果差异基因数目

3 讨论

心肌纤维化与动脉硬化等多种疾病相关，是大多数心血管疾病病理学改变的重要部分。现代研究表明，通过高脂饮食饲养成功建立兔动脉粥样硬化模型，且该模型出现了明显的心肌纤维化，同时心肌组织中AngⅡ表达升高、MMP-1表达降低，认为该心肌纤维化可能与AngⅡ、MMP-1[9,11]有关。因此，本研究也用AngⅡ、MMP-1这两个指标来对比各组小鼠的心肌纤维化程度。

本研究结果表明，越鞠保和丸联合辛伐他汀相比单用辛伐他汀可以有效的降低TC、TG、LDL-C、AngⅡ和升高HDL-C、MMP-1，并且masson染色CVF值也明显降低，这表明越鞠保和丸联合辛伐他汀比单用辛伐他汀可以更有效的逆转动脉硬化导致的心肌纤维化。从高通量转录组测序差异基因分析结果来看，越鞠保和丸联合辛伐他汀与正常对照组相比，差异基因表达主要集中在脂肪酸的代谢（fatty acid metabolism）、延长（fatty acid elongation）和降解（fatty acid degradation）上，而与模型对照组相比，差异基因表达主要集中在原发性免疫缺陷（primary immunodeficiency）和肠道免疫网络的IgA的产生（Intestinal immune network for IgA production），这表明越鞠保和丸联合辛伐他汀并不是通过逆转脂肪酸的各种代谢途径而是通过调控免疫炎性反应来逆转动脉粥样硬化导致的心肌纤维化。

辛伐他汀为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶抑制剂，抑制内源性胆固醇的合成，为血脂调节剂，其作用的通路和靶点较为明确[12,13]。越鞠保和丸为理气剂，具有疏肝解郁，开胃消食之功效，可用于治疗六郁，六郁常因饮食不节，寒温不适，喜怒无常，忧思无

度，气机运行失常而发病。肝喜条达，怒气伤肝，气郁则胸膈痞闷；肝藏血，气郁者血瘀，出现胸胁痛，或月经不调，痛经等；肝与胆互为表里，为相火寄居之所；气郁化火，则口苦泛酸，此气、血、火郁在肝胆，肝病及脾，使脾失运化，导致湿郁、痰郁；不能运化水谷则食郁；食、痰、湿三者壅滞中焦，则胀满不食、吞酸呕吐诸症丛生；此证虽有气、血、火、湿、痰、食六郁，而实际多为肝脾郁结为病。中医学中的肝脾与现代医学中的消化系统内涵相近。越鞠保和丸的作用通路和靶点虽然尚不明确，但是越鞠保和丸在临床应用上未见不良反应报道，而2013年中国食品药品监督总局（CFDA）发布修订他汀类药品说明书通知，提醒中国医生和患者关注他汀安全性[14]。目前辛伐他汀潜在的不良反应主要有肌病[15][16]、转氨酶升高[17,18]、增加新发糖尿病风险[19,20]等。因此，越鞠保和丸联用辛伐他汀可以在不增加他汀药物用量的情况下提高逆转动脉粥样硬化导致的心肌纤维化的疗效，间接的降低了他汀类化学药物的风险，这体现出了中医药的优势。

图3 YBS组和M组差异基因KEGG富集散点图（解释同图2）

图4 M组和N组差异基因KEGG富集散点图（解释同图2）

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