Notch信号通路及miRNA在结直肠癌中的研究进展*

蒋海涛，何沂洋，刘 霞 综述，王 红 审校

(遵义医学院附属医院消化内科 563003)

Notch信号通路及miRNA在结直肠癌中的研究进展*

蒋海涛，何沂洋，刘 霞 综述，王 红△审校

(遵义医学院附属医院消化内科 563003)

结直肠肿瘤；Notch信号通路；miRNA；研究进展

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，随着生活习惯和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率呈逐年上升趋势，在我国及世界范围内其发病率高居恶性肿瘤的第3位[1]。其早期缺乏特异性的临床表现，而侵袭和转移又使中晚期结直肠癌的治疗面临巨大的挑战，转移性结直肠癌的5年存活率低于20%[2]。结直肠癌的发生、发展是涉及多个基因、多个步骤的复杂过程，但其具体机制尚不明确，因此探索结直肠癌发生、发展的分子机制，确立防治靶点，寻求新的干预策略以提高对结直肠癌的防治是目前的研究热点。大量研究表明，Notch信号通路、Wnt/β-连环素信号通路、转化生长因子-β/Smad、核因子-κB(NF-κB)、RAS/MARK等信号通路及微小RNA(miRNA)、肿瘤干细胞等在CRC的发生、发展中起着至关重要的作用。本文就Notch信号通路及miRNA在结直肠癌中的研究进展做一综述。

1 Notch信号通路与CRC

1.1Notch信号通路概述 Notch基因是由Morgan等在1919年从突变的果蝇中发现的，是一个相对分子质量约为30×103的单次跨膜受体蛋白家族。Notch信号通路广泛存在于脊椎和无脊椎动物中，在遗传进化的过程中高度保守，在细胞的生长、发育、分化、凋亡等生物学行为中起着至关重要的作用，被称为“细胞命运决定者”。Notch信号通路与机体多种肿瘤的发生相关，当Notch信号表达异常,细胞增殖能力增强,可进一步导致肿瘤的发生。近年来，大量研究表明Notch基因在CRC组织中表达异常，证明Notch信号通路与CRC的发生、发展密切相关。在脊椎动物中Notch信号通路主要由Notch受体、Notch配体及转录因子CSL组成，4种Notch受体分别为Notch1、Notch2、Notch3和Notch4，成熟的受体由胞外域(NEC)、跨膜区(NTM)和胞内域(NIC)构成；Notch配体又称为DSL蛋白，5种Notch配体分别为DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2。CSL是一种DNA结合蛋白，是3种转录因子CBF-1、Suppressor of Hairless、Lag-1的缩写，能识别并结合特定的DNA序列。

1.2Notch信号通路与肿瘤 当Notch配体与Notch受体结合，经过2次蛋白酶切后释放Notch的活化片段NIC，NIC在细胞核中与CSL蛋白结合，组成转录活化复合体，从而发挥对靶基因的调控作用,最终影响细胞的增殖、分化、凋亡等。Notch通路的靶基因有Hes家族、Herp/Hey家族、Hath1/Math1等。Notch的靶基因Hes1可抑制静止母细胞的早衰或分化，在肿瘤组织中，高表达的Hes1使细胞逃避分化和不可逆的细胞周期停滞，从而导致肿瘤的发生，阻断Hes1的表达可诱导肿瘤细胞的分化和凋亡。在CRC中，Hes1通过诱导上皮间质转化可以促进肿瘤细胞的侵袭和转移，并可作为患者预后不良的指标[3]。Notch信号的靶基因Hath1在结直肠肿瘤及结肠癌细胞株中的表达明显下调，且与细胞分化标记物MUC2密切相关；Hath1可促进结直肠分泌细胞(杯状细胞、潘氏细胞等)的分化而发挥抑癌作用，而高表达Notch信号可抑制这一过程，通过靶向阻断Notch-Hath1通路有望发挥Hath1的抑癌作用[4]。

由于 Notch 信号通路的“共享性”及其配体、受体、靶基因的多源性，其调控机制相当复杂。在不同部位的肿瘤及在同一肿瘤的不同发展阶段，Notch信号的表达不尽相同，既可表现为致癌作用，亦可表现为抑癌作用。DLL-1在肝癌组织中的表达较正常组织明显升高，提示DLL-1在肝癌中发挥致癌作用；而在宫颈癌中，Notch1早期阶段表现为促癌作用，晚期则表现为抑癌作用。

1.3Notch信号通路与CRC 结直肠是一个反复更新的器官，结直肠干细胞存在于结肠隐窝基底部，需要在适当的微环境下调节细胞的增殖、分化及凋亡等生物学行为，当Notch信号异常表达，可使正常的微环境发生变化，导致结直肠肿瘤的发生。近年来研究表明，Notch信号在维持肿瘤干细胞特性中发挥关键作用，CRC的形成可能是Notch信号通路对肿瘤干细胞的调控失调所致，但其具体机制尚不清楚。在CRC中，肿瘤干细胞标记物LGR5、CD133、CD44、MUSASHI-1、Hes1等表达与Notch信号表达明显相关[5]。本课题组的研究也发现，在结直肠腺瘤、腺癌中随着Notch3表达率和表达强度的逐渐升高，CD133、LGR5的表达亦逐渐增强，由此认为Notch信号通路通过调节结直肠肿瘤干细胞的增殖、分化等在CRC的发生、发展中发挥关键作用。

Notch信号通路对结直肠黏膜的更新和自稳起重要作用，Notch1是Notch信号通路的主要受体，主要表达在结肠隐窝下端1/3的增殖区，在调控细胞增殖、分化及凋亡中发挥重要作用。目前Notch信号通路的研究中Notch1的研究最多，大量研究表明Notch1可抑制结直肠黏膜杯细胞的终末分化，诱导未分化细胞向恶性转化，在CRC中发挥致癌作用。体外细胞实验发现Notch1的过表达可明显促进结肠癌细胞的增殖、集落形成和肿块生成，并抑制细胞自发凋亡。在CRC中，Notch1的表达较正常结肠组织、结肠腺瘤明显升高。Huang等[6]的研究发现，Notch1在结直肠腺瘤和腺癌中的表达率分别为14.7%和58.0%，表明Notch1在CRC中发挥癌基因的作用；进一步研究发现Notch1与CRC的转移及患者预后存在明显相关性[7]。而Notch2表达水平高的CRC患者预后明显好于Notch2表达水平低的患者，提示Notch2在CRC中可能发挥抑癌基因的作用[8]。Jagged1、Notch1的表达率和表达强度明显高于癌旁组织和正常组织，且二者蛋白表达呈正相关；沉默Jagged1可减弱结肠癌细胞株体外迁移和侵袭能力；敲除Jagged1的结肠癌细胞生长速度显著低于对照组，并伴随着细胞增殖标志物PCNA、Ki-67、c-Myc及转移标志物基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的下调。

1.4Notch信号通路与CRC的靶向治疗 目前，研究Notch信号通路治疗肿瘤的靶点主要有3个：(1)抑制NICD的释放；(2)阻断Notch受体与Notch配体的结合；(3)作用于共激活复合物，减少靶基因的转录活化。γ-分泌酶抑制剂是Notch活化过程中所必需的一种水解酶，DAPT作为一种γ-分泌酶抑制剂，可抑制Notch受体有效的胞内段NICD释放进入细胞核，从而阻断Notch信号通路。本课题组的研究发现，使用Notch信号通路阻断剂DAPT作用于结肠癌HT-29细胞株后，结肠癌细胞体外增殖的能力明显受到抑制[9]。胡敏等[10]的研究也发现，使用γ-分泌酶抑制剂对耐药细胞株SW480/L-OHP的增殖具有抑制作用，可提高化疗的敏感性，而联合L-OHP使用后抑制作用更加明显。

1.5Notch信号通路与其他信号通路在CRC中的串话 Notch信号通路在肿瘤的发生、发展过程中并不是孤立的，与其他多条信号通路间存在广泛关联和串话，比如Hedgehog通路可调控Jagged2的表达，而Wnt/β-catenin则可调控Jagged1的表达。Hes-1既可被Notch信号通路激活，又可被Hedgehog通路激活。在CRC中亦是如此，如β-catenin/Tcf可上调Jagged1的表达从而激活Notch信号通路；Ungerback等[11]的研究中发现，Notch信号通路可能受Wnt通路的调控，而Notch2可作为Wnt信号通路的靶基因。Notch1和NF-κB都是导致CRC发生的独立因素，二者之间的互相调控及协同作用可能是影响疾病预后和治疗的决定性因素。TGF-β/Smad信号通路可通过激活Notch、Hedgehog、Wnt、Ras通路而促进上皮间质转化[12]。综上所述，Notch信号通路与其他众多信号通路之间存在着紧密联系，若改变其中之一的信号转导情况，可能会对其他通路造成潜在的影响。

2 miRNA与结直肠癌

2.1miRNA概述 miRNA是一类长度为22 nt的内源性非编码小分子单链RNA，广泛存在于动植物中，是近年来国内外研究热点。miRNA通过与序列互补的靶基因mRNA结合而抑制mRNA的翻译或使RNA诱导的沉默复合体降解mRNA，从而在转录水平负向调控靶基因的表达，在调节细胞增殖、分化及凋亡等几乎所有生物学行为中都发挥了重要作用。现已发现的哺乳动物体内至少存在1 000多种miRNA，miRNA仅占人类基因总量的2%，却调控着超过基因组内约1/3基因的表达[13]。因此，miRNAs的异常表达将可能导致一系列疾病的发生。

2.2miRNA与肿瘤 研究发现miRNA广泛参与了肿瘤发生、发展及转移等过程，若干miRNA在各种肿瘤组织中的表达水平有不同程度的上调或下调。在肿瘤组织中，部分miRNA分子能够影响正常的信号转导，可能扮演着类似癌基因或抑癌基因的作用。2002年，Calin等[14]发现miR16和miR15 2个miRNA位于健康人染色体13q14上，而超过半数的慢性淋巴细胞白血病患者常发生13q14染色体缺失，提示miRNA与肿瘤密切相关。目前研究发现的miRNAs约有50%位于染色体上与肿瘤相关的区域，与正常组织相比，肿瘤组织中的部分miRNA表达存在明显差异。miRNA在肿瘤中发挥抑癌或致癌作用主要取决于特定靶基因的微环境及miRNA的表达水平。如miR-200在肝癌、胃癌、卵巢癌、肾透明细胞癌、脑膜瘤、鼻咽癌等大部分肿瘤中表达下调，而在一些肿瘤中则表达上调，如在胰腺癌、食管腺癌；提示miR-200在上述肿瘤组织中可能分别扮演抑癌基因或致癌基因的角色[15-16]。此外，miRNA与肿瘤的转移亦密切相关，主要机制包括调控肿瘤细胞上皮-间质转化、调控癌基因或抑癌基因表达、调控肿瘤细胞生长微环境及对肿瘤血管生成的调控等。目前研究发现的与肿瘤转移相关的miRNA至少有40种，如miR-100通过靶向作用于ZBTB7A可抑制胃癌的转移，miR-503通过靶向作用于PRMT1可抑制肝癌的转移[17]。

2.3miRNA与CRC miRNA与CRC关系密切，与正常结直肠组织相比，多种miRNA在CRC中的表达存在明显差异。Slattery 等[18]通过分析1 893例结直肠癌、290例结直肠腺瘤与正常结直肠黏膜组织中miRNA的表达情况，发现有近600种miRNA在结直肠组织中表达，其中86.5%的miRNA表达存在显著差异，而这其中又有大约一半miRNA的表达从正常黏膜-腺瘤-癌存在递进关系。研究表明有18个miRNAs(miR-378a-3p、-155-5p、-193b-3p、-96-5p、-17-5p、-27a-3p、-133b、-203a、-205-5p、-34c-5p等)在CRC中表达下调[19]。Taniguchi等[20]的研究发现miR-124在正常结直肠组织、结直肠腺瘤、腺癌中的表达逐级下调，其通过作用于PTB1/PKM1/PKM2轴诱导肿瘤细胞凋亡和自噬，可能扮演肿瘤抑制剂和能量代谢调节器的作用。miR-26a 和miR-584通过抑制hnRNP A1-CDK6 mRNA的表达可促进CRC细胞凋亡。此外，某些miRNAs与肿瘤的分级、转移等密切相关，如在CRC中表达下调的miR-518a-3p与肿瘤大小、远处转移及TNM分期密切相关[21]；而 miR-16除与肿瘤的分化、TNM分期及肿瘤复发相关外，还与患者的预后密切相关，低表达miR-16的CRC患者5年生存率(31.2%)明显低于高表达miR-16的患者(58.3%)。miRNA不仅存在于组织中，还可稳定的存在于血浆、粪便及尿液中。研究者运用RT-qPCR方法检测了353例血浆标本中的miRNA含量(包括111例结直肠腺癌、59例腺瘤、24例息肉、29例炎症性肠病以及130例健康对照者)，发现miR-24、miR-320a和miR-423-5p在CRC中表达明显下调，其在早期CRC患者血浆中的敏感性分别为77.78%、90.74%和88.89%[22],由此认为miR-24、miR-320a和miR-423-5p可作为CRC早期诊断的潜在检测指标，并优于现有的肿瘤标记物，诸如CEA、CA19-9等。

2.4miRNA与CRC的治疗 CRC的综合治疗中，化疗一直占据着重要地位，进展期CRC化疗失败的主要原因之一是对肿瘤化疗药物产生耐药性。miRNA在转录后水平对基因的蛋白表达进行调控，不仅影响了疾病的发生、发展过程，还可以作为某些药物的靶标或协同剂，帮助药物发挥更好的疗效。miR-218通过抑制BIRC5和胸苷酸合酶的表达而增强5-FU的化疗效果并促进细胞凋亡，高表达的miR-218在5-FU的治疗上具有积极的预后作用[23]。而Amankwatia等[24]的研究发现，在miR-224被敲除的结肠癌细胞株中5-FU的化疗效果明显增强，其机制可能是miR-224促进肿瘤细胞增殖、侵袭和上皮间质转换。miRNA还能影响肿瘤细胞中ATP依耐性级联外排泵蛋白(ABC)家族的表达和活性，如miR-451可下调ABCB1的表达而恢复耐药肿瘤细胞对伊立替康的敏感性[25]。Yang等[26]发现，对阿霉素耐药的结肠癌细胞中miR-522表达明显下调，过表达的miR-522可能通过下调ABCB5蛋白的表达水平，而影响结肠癌细胞对阿霉素化疗的敏感性。此外miR-200c可通过负向调控JNK信号通路(下调JNK下游基因p-JNK、p-c-Jun,、P-gp、MMP-2/-9的表达)，而增加结肠癌细胞对化疗药物的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，抑制其迁移和侵袭[27]。因此，miRNA可作为抗癌药物的辅助剂来改善肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。

3 Notch信号通路联合miRNA在CRC中的作用

Notch信号通路作为CRC的经典信号通路一直是国内外研究的热点，越来越多的研究表明miRNA对Notch信号通路的调控作用在肿瘤中发挥着重要作用。在绒毛膜癌中，miR-34a可通过下调Notch信号通路中Notch1、Jagged1的表达而抑制细胞的增殖和侵袭能力[28]。近年来较多研究认为miR-139-5p是潜在的抑癌基因，在CRC组织和耐5-FU的结肠癌细胞中miR-139-5p表达下调，进一步研究发现miR-139-5p可靶向作用于Notch1及其下游的2个肿瘤耐药相关基因MRP-1、BCL-2并抑制其表达，沉默Notch1的表达可增强肿瘤细胞对5-FU的化疗效果，而上调Notch1的表达则可解除miR-139-5p调节肿瘤细胞对化疗药物的敏感性的作用[29]。Wang等[30]的研究表明，miR-206可能通过靶向作用于Notch3而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移并促进其凋亡。

4 展 望

近年来Notch信号通路一直是CRC研究的热点，大量文献资料表明Notch信号通路在CRC的发生、发展中发挥着重要作用；同时随着miRNA研究的不断深入，学者们筛选出了越来越多与CRC相关的miRNA分子。但目前国内外关于miRNA-Notch轴在CRC及其他不同部位肿瘤中的研究仍然较少，目前研究已表明Notch信号通路可在多个层面受到干扰，如抑制Notch受体与配体的结合，干扰Notch胞内段与CSL蛋白结合等，但目前的研究都缺乏突破性的进展。由此学者们大胆认为，是否可在Notch信号通路的上游对Notch mRNA进行调控，筛选出可靶向作用于Notch信号通路的miRNA，以miRNA-Notch信号通路轴为中心进行深入研究寻求突破，且目前的研究也取得了初步成效，笔者有理由相信miRNA-Notch轴在CRC的早期诊断和靶向治疗上将很有前景。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.043

R735.3

A

1671-8348(2017)27-3875-03

2016-11-16

2017-04-03)

贵州省科技计划课题(黔科合SY字[2013]3006号)；贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2010]2172号)。

蒋海涛(1989-),住院医师，主要从事大肠癌的防治方面的研究。△

，E-mail:wanghong89zy@163.com。