人骨髓间充质干细胞与羊膜间充质干细胞的研究进展*

陈锐憬 综述，史明霞 审校

(昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心 650032)

人骨髓间充质干细胞与羊膜间充质干细胞的研究进展*

陈锐憬 综述，史明霞△审校

(昆明医科大学第一附属医院血液科/云南省血液病研究中心 650032)

间质干细胞；人骨髓间充质干细胞；羊膜间充质干细胞

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)广泛存在于机体的各种组织器官中，例如骨髓、脂肪、羊膜、脐带等。最初MSC是在骨髓中被发现的，因此骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)被认为是干细胞的最好来源，并且用BMSC作为衡量其他组织干细胞来源的标准[1]。在其他组织来源的MSC中，羊膜间充质干细胞(amniotic mesenchymal stem cells,AMSC)因具有增殖能力强、免疫原性低和来源无伦理学争议等特点备受专家学者们的关注，被视为BMSC的理想替代物。本文就BMSC和AMSC的生物学特性、免疫调节机制及临床运用的潜在价值进行综述。

1 人羊膜间充质干细胞(hAMSC)和人骨髓间充质干细胞(hBMSC)的分离、培养和扩增

hBMSC主要来源于骨髓，需经有创操作进行采集，具有一定伦理学争议。hBMSC常用的体内分离方法有4种：密度梯度离心法、全骨髓贴壁分离法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。其中密度梯度离心法应用最广泛也最为经典，此方法获得的hBMSC纯度高，增殖活性强，但操作复杂，故研究者常用简单易行的贴壁法与此结合。最近，有学者探索使用一种BMSC过滤装置分离纯化MSC，这种滤过装置可快速、高效、可靠地分离BMSC，避免BMSC被外界污染物污染[2]。BMSC最常用的培养液是含10%～20%胎牛血清的DMEM培养基。MSC在骨髓中的含量稀少，大约1×105～1×106个单核细胞中含有1个MSC，体外分离培养、扩增纯化在科学研究及临床应用当中就显得尤为重要。研究表明，hBMSC可稳定培养15代左右，而在第15代以后，细胞逐步出现衰老现象，在体外传代培养20代以后，细胞生长明显变慢，并呈现明显的老化现象。

hAMSC是由胚胎发育过程中的胚外中胚层发育而来，是将羊膜组织剪碎用组织贴壁法或胰蛋白酶-胶原酶消化法分离得到的AMSC，采集过程对母体和新生儿不造成任何损伤，不受伦理学和临床医学的限制。国内外文献报道hAMSC的分离培养尚无统一的方法，最常用的分离方法是组织块贴壁法和胰蛋白酶-胶原酶消化法。Parolini等[3]发现，1 g羊膜组织理论上应该含有5×108个hAMSC。通常，1 g组织中hAMSC的产量约为1×106～2×106个。研究发现，hAMSC传至3～5代后，细胞排列紧密，形态与成纤维细胞类似，以放射状漩涡样生长[4]。hAMSC不能够自我分化，也不会增殖超过70代[5]。

2 hBMSC和hAMSC的生物学特性

2.1表面标志及基因表达 目前，还没有特异性的抗原可以直接鉴定hBMSC，它不仅表达间质细胞表面抗原，还可以表达内皮细胞、上皮细胞、肌肉细胞的表面抗原，但不表达造血细胞的表面抗原[6]。BMSC可表达的主要表面抗原有黏附分子类，如CD106、CD44、CD54、CD102、CD166等；整合素家族，如CD29、CD49、CD104等；生长因子和细胞因子受体家族，如IL-1R、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R等；干扰素受体；肿瘤坏死因子受体等，不表达CD34、CD45、CD14等造血干细胞表面标志。

hAMSC也没有特异性的表面抗原，但随着分选干细胞侧群技术在多分化潜能干细胞中的广泛应用，研究者们通过用流式细胞仪、聚合酶链反应或者免疫细胞化学染色来分析hAMSC表面抗原标志后发现，hAMSC可以表达间质细胞表面抗原，如CD73、CD90、CD105，也可以表达CD10、CD13、CD29、CD44、CD49c、CD49d、CD49e、CD54、CD140b、CD166、CD349、STRO-1和HLA-ABC。在使用聚合酶链反应检测时，CD271和CD117(ckit)为弱表达。hAMSC不表达造血标志抗原CD34、CD45，单核细胞标志物CD14和内皮细胞标志物CD31、CD133、CD3及CD11[7]。但是Chika等[8]用流式细胞仪检测出hAMSC可以表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45、HLA-DR和CD14，阳性率分别为3%、17%、14%和10%。Chika等[8]还通过定量RT-PCR检测来衡量间充质干细胞标志物，发现载脂蛋白D的阴性标志物在hBMSC和hAMSC中的表达都很低，但是在hAMSC中的含量还要比hBMSC低100倍；LIF和MGP都是MSC的阳性标志物，其中LIF和MGP在hBMSC中的表达率分别是AMSC的1.5倍和2 200倍，这说明BMSC和AMSC具有其各自不同的特性；他们继续用定量RT-PCR来分析Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog及Lin28基因在hBMSC和hAMSC中的表达情况，发现hAMSC的Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog及Lin28基因表达率均要高于hBMSC，提示hAMSC的干细胞特性要比hBMSC更接近于诱发型多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。Oct3/4是胚胎干细胞表面标志，对胚胎干细胞的增殖和多向分化具有重要作用，我国学者在研究hAMSC和hBMSC的生物学特性时发现，hAMSC可表达Oct3/4，而hBMSC不表达，进一步证明了hAMSC比hBMSC具有更强的干细胞特性[9]。

2.2免疫原性及免疫调节和抑制功能 hBMSC和hAMSC一样，均只能表达低水平的MHC-Ⅰ类分子，不表达MHC-Ⅱ类分子及B7-1、B7-2、CD40、CD40L等T细胞共刺激分子，所以这两种MSC都具有较弱的免疫原性，在组织移植中不易引起免疫排斥反应[10]。MSC可分泌转化生长因子-β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)及PGE2等抑制T细胞的增殖、活化和防止免疫排斥反应；可产生IDO并通过色氨酸途径抑制B细胞的增殖与活化，抑制自身免疫作用；还可通过降低自然杀伤(NK)细胞γ-干扰素(IFN-γ)的分泌参与NK细胞的免疫调节[11]。有学者将hAMSC与人或兔的外周血单核细胞以不同比例进行混合培养，发现hAMSC可以抑制单核细胞的增殖，且当hAMSC与单核细胞的比例为1∶5时抑制效果最显著；用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测混合培养以后的上清液发现，T细胞所分泌的白细胞介素2(IL-2)和IFN-γ细胞因子的水平显著下降，且hAMSC加入的量与IL-2和IFN-γ的分泌量呈反比[12]，说明hAMSC可通过抑制IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌间接作用或细胞间直接接触调节各类免疫细胞活性而发挥其免疫抑制作用，hAMSC具有低免疫原性，为其在干细胞移植治疗中预防移植物抗宿主病提供了依据。因此，MSC免疫调节的研究潜力在很大程度上取决于其分泌的可以调节免疫细胞活性和影响细胞微环境的可溶性因子。随着对MSC免疫调节性质的不断研究，许多学者认为MSC的免疫调节特性是不成立的，MSC受到微环境中不同炎症介质的诱导，并在不同炎症刺激下表现出较高的功能可塑性，使其不仅能抑制免疫反应，也能增强免疫效应[13]。

3 hBMSC和hAMSC的临床应用前景

hBMSC具有分化为骨细胞、软骨细胞、上皮细胞等的多向分化潜力，且易取样分离，具有弱的免疫原性，在组织工程和临床应用的研究当中备受青睐。最新研究表明，多种细胞因子都可促进BMSC分化为骨细胞和软骨细胞，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成骨蛋白2(bone morphogenie protein 2,BMP-2)。有学者就将BMP-2/VEGF-165基因转染后的BMSC通过关节镜髓芯减压移植入兔股骨头坏死的骨髓腔中，发现移植4周后即有新生骨生成，移植8周后，股骨头坏死区域的缺损骨质已基本被修复，骨质也得到了改善，骨质修复的生理期限也有所缩短。表明人BMP-2/VEGF-165基因转染的BMSC在股骨头坏死的临床治疗中具有可观的疗效[14]。在缺血性心脏病的研究当中，有学者构建了一种双特异性抗体，并辅助BMSC移植入心肌纤维化小鼠体内，发现这种双特异性抗体可以提高小鼠BMSC的归巢率，显著提高了干细胞移植治疗缺血性心脏疾病的移植效率[15]。以往研究表明，增加体内Th17细胞和减少Treg细胞都可以触发炎性疾病[16]。BMSC可以通过调节炎性细胞因子的血清水平显示出有效的免疫抑制和抗炎作用[17-18]。有学者将IL-10通过基因工程转染入BMSC中，再将转染后的BMSC引入到大鼠同种异体肝移植中，发现移植MSCs-IL-10组的大鼠与盐水组的大鼠相比存活时间更长，且Treg细胞相关细胞因子(IL-10和TGF-β1)和转录因子(FoxP3)的表达也显著增加，同时Th17细胞相关的细胞因子(IL-17，IL-6，IFN-γ，TNF-α和IL-23)和转录因子(RORγt)显著减少[19]。表明BMSC在肝脏疾病的临床治疗应用中具有重要价值。随着hBMSC研究的不断深入，越来越多的学者将目光从动物实验转向了临床应用的研究。矽肺是一种不可逆的难以治愈的疾病，其特征是肺间质病变和肺部广泛的结节性的纤维化。有学者为了研究hBMSC和肝细胞生长因子是否对矽肺的治疗有效，将经肝细胞生长因子转染过的自体BMSC以每公斤体质量2×106个的细胞量静脉输注到患者体内，并连续输注3周，结果发现患者的咳嗽、胸闷症状在干细胞输注后的6个月逐渐好转，肺功能也显著改善，说明hBMSC的多向分化潜能和免疫调节特性在矽肺的临床治疗中具有重要研究意义[20]。在乙型肝炎相关肝硬化治疗中，有学者在对患者进行自体BMSC移植的研究中发现，自体BMSC移植可以明显升高血清中炎性因子TGF-β水平，高浓度TGF-β诱导的FoxP3可通过拮抗RORγt的功能来抑制Th17的分化。自体BMSC移植有望改善患者的肝功能，纠正乙型肝炎相关肝硬化患者体内Treg/Th17细胞的比例失衡，在以后的临床治疗当中拥有巨大的潜力[21]。现今，自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHSCT)已越来越多地被用于恶性血液性疾病的治疗中，然而移植早期淋巴细胞复苏率低也决定了AHSCT需要进一步优化来提高移植效率。AHSCT的移植率取决于造血干细胞的植入和造血恢复的有效性，其在很大程度上也是由骨髓基质细胞决定的，移植前持续高剂量化疗使得骨髓基质细胞严重受损，而BMSC的独特的造血刺激活性可促进基质细胞再生。Batorov等[22]比较了BMSC与自身造血干细胞共移植和标准自体造血干细胞移植在治疗恶性血液病患者中的疗效，并且首次发现共移植组更能促进移植早期淋巴细胞的恢复，尤其是记忆T细胞和幼稚T细胞的恢复，能有效改善造血干细胞输入量低或者机采淋巴细胞绝对值低患者的淋巴细胞复苏情况。这为临床提供了一种改善造血干细胞移植疗效的新方法。

hAMSC可以分泌比hBMSC更为丰富的造血细胞因子，拥有更强的扩增能力和免疫原性低等优势，是组织工程再生医学领域的重要生物材料来源。有学者将hAMSC与hBMSC共培养后发现，hAMSC不仅具有成骨分化能力，还可以促进hBMSC的增殖及分化为成骨细胞，并能促进成骨细胞的生长和碱性磷酸酶的合成，也可上调骨生成相关蛋白在成骨细胞中的表达[23]。促进间充质细胞骨再生的研究还需进一步建立动物模型实验，更好地应用于再生医学。最近有研究表明，hAMSC所具有的免疫特性可能被运用到自身免疫性疾病的治疗当中。Shu等[24]将hAMSC注入人类类风湿关节炎大鼠模型的腹腔内，发现hAMSC可显著改善大鼠关节炎的严重程度，降低关节炎的病理改变，同时可显著抑制促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌。此外，hAMSC可以显著提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和抗氧化能力，同时降低丙二醛的水平，具有抗氧化的能力。hAMSC可以减缓大鼠模型中关节炎疾病的进展，这可能是治疗类风湿性关节炎的一个很有希望的细胞来源。Yamahara等[25]研究了hAMSC和人绒毛膜间充质干细胞(human chorion-derived mesenchymal stem cell,hCMSC)在细胞功能和治疗性质上的差异，证实了hAMSC和hCMSC均可以分泌大量有助于促进再生作用的可溶性因子，例如各种生长因子和细胞因子，包括VEGF、胰岛素样生长因子-1、肝细胞生长因子、肾上腺髓质素和前列腺素E2(prostaglandin E2，PEG2)。发现hAMSC所分泌的PEG2浓度要明显高于hCMSC，尤其是将两种间充质干细胞与CD4+T细胞共培养时。他们还将两种MSC移植入GVHD动物模型中，首次证明了hAMSC可以更好地改善急性GVHD动物模型的病理情况[25]。有研究证明，hAMSC可以显著抑制Th1/Th7细胞的增殖和分化[26]，并通过有效抑制Th1/Th7细胞的免疫特性来缓解GVHD。因此hAMSC在防治GVHD方面有着潜在的广阔前景。

4 展 望

综上所述，hAMSC虽然与hBMSC具有相似的细胞形态、生长特性、细胞表型、多向分化潜能、免疫原性及免疫调节作用，但是仍存在着一定差异,hAMSC比hBMSC具有更强的增殖能力和干细胞特性,这可能与二者的来源稍有差异有关。hAMSC在羊膜中的含量要远多于hBMSC在骨髓中的含量，且羊膜的获取几乎不存在伦理学争议；hAMSC的干细胞相关基因表达水平均要高于hBMSC。但是这两种间充质干细胞具体的差异性及哪种细胞更适合作为细胞组织工程种子细胞及用于多种疾病的细胞治疗等问题，需要进一步更深入的研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.039

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A

1671-8348(2017)27-3863-04

2016-11-15

2017-04-02)

国家自然科学基金资助项目(31260232)；云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目(2010CI013)；云南省科技厅昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助项目(2012FB031)。

陈锐憬(1991-)，在读硕士，主要从事干细胞移植及血液肿瘤方面的研究。△

，E-mail:shmxia2002@sina.com。