老年糖尿病肾病患者血浆差异蛋白的表达

傅明捷 王衍慧 李 静 傅君舟 黄玉宇 黄 萍 赵路宁

(广州市第一人民医院老年病科，广东 广州 510180)

老年糖尿病肾病患者血浆差异蛋白的表达

傅明捷 王衍慧 李 静 傅君舟 黄玉宇 黄 萍 赵路宁1

(广州市第一人民医院老年病科，广东 广州 510180)

目的 探讨老年糖尿病肾病(DN)与健康人群血浆差异蛋白的表达。方法 选取老年DN患者10例(试验组)，同期查体健康人群10例(对照组)，采用荧光差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)检测老年DN患者及健康志愿者血浆蛋白质组的表达情况，以差异表达1.5倍为截断值挑选蛋白质斑点并行质谱分析。结果 应用老年DN患者及健康志愿者血浆成功构建差异表达双向凝胶电泳图谱，并分析筛选出33个差异表达斑点，通过质谱分析数据库比对鉴定出6种差异表达蛋白。结论 2D-DIGE技术可有效筛选老年DN相关特异蛋白，为进一步筛选DN血清标志物提供依据。

糖尿病肾病；血浆蛋白；蛋白质组

糖尿病肾病(DN)为糖尿病(DM)最常见并发症，已成为我国面临的严重公共卫生问题〔1，2〕。本研究拟用DN患者与健康人群血清蛋白为研究材料，采用荧光差异双向凝胶电泳(2D-DIGE)技术与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术相结合，进行动态蛋白质组学研究分析，筛选出DN特异表达的蛋白，并对感兴趣的蛋白进行生物功能的鉴定，从分子角度阐明DN的生物学基础和机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年10月至2014年5月广州市第一人民医院老年病科住院的老年DN患者10例(试验组)，男8例，女2例；年龄60～80岁。同一时间内健康志愿者10例(对照组)男8例，女2例；年龄60～80岁。两组患者年龄及性别完全匹配。纳入标准：患者24 h尿蛋白排出>500 mg；年龄60～80岁；血肌酐≤140 μmol/L；知情同意者。排除标准：肾小球滤过率<30%；血肌酐>140 μmol/L；心衰患者、人获得性免疫缺陷病毒(HIV)阳性者、孕产妇。

1.2 主要试剂与仪器 过硫酸铵；二硫苏糖醇(DTT)；血清去高分度蛋白试剂盒；超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；等电聚焦仪。

1.3 方法 血清的采集及处理：清晨空腹抽取上述两组患者静脉血10 ml，速冻存于液氮中，再置于-70℃保存，备双向电泳及质谱分析用。双向电泳及质谱分析 提取两组人员血清总蛋白，用2D Quant Kit蛋白质定量试剂盒测定总蛋白浓度。每组取25 μg充分混合(内参)，50 μg内参用400 pmol Cy2标记，分别Cy3和Cy5标记，避光置于冰上放置半小时，再加1 μl亮氨酸(10 mmol/L)中止反应10 min。上样，30 V水化13 h，然后经过100 V 0.5 h、500 V 0.5 h、1 000 V 1 h、5 000 V 1 h，8 000 V等电聚焦8.5 h。最后对胶条进行扫描并获取清晰的图像用于后处理分析。首先对获得的图像结果应用ImageMaster 5.0进行图像分析处理，并获得数据，进而采用Graphpad5.0软件进行相关数据处理。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

以健康人为参照，DN患者上调或下调1.5倍为截断值，同时满足P<0.05的差异斑点有33个。软件检测对获得的结果选定12个挖点进行胶内酶切，并行质谱分析，经检索相关数据库，比对鉴定出6种蛋白质，见表1。其中血清甲状腺素运载蛋白和血液结合素和匹配率最高，分别为49%和20%。血液结合素(B28)及血清甲状腺素运载蛋白(A41)肽指纹图谱见图1。

表1 筛选出的差异表达蛋白

图1 肽指纹图谱

3 讨 论

DN血清蛋白质组学方面的研究也取得了一定的进展，可以在一定程度上弥补肾组织和尿液蛋白质组学研究的局限性〔3，4〕。Kim等〔5〕研究发现细胞外谷胱甘肽过氧化物酶和载脂蛋白E在微量白蛋白尿(MA)和慢性肾衰竭(CRF)组血清中的表达进行性减少，可以作为2型DN的生物标志物。Overgaard等〔6〕利用SELDI-TOF-MS研究了单纯1型糖尿病、1型糖尿病伴微白蛋白尿、1型糖尿病伴大量白蛋白尿三组患者的血清蛋白表达谱变化。发现三组Apo A1的表达水平均下调，其中第三组的下降最为显著。Apo C1在三组的表达水平均下调，其中第三组的下降具有显著差异(P=0.012)。transthyretin和cystatin C在第三组的表达水平较其他组均有显著差异(P<0.000 1)，但第一、第二组间表达水平无显著差异。因此，血清Apo A1、Apo C1、transthyretin和cystatin C的表达变化可辅助评估1型糖尿病的肾脏病变程度。以上DN蛋白质组学研究取得了很多进展与突破，初步揭示了DN的部分分子机制，发现了一些与DN相关的蛋白，但这些研究仍然存在不同程度的缺陷与不足：①大部分研究在结果分析时仅采用t检验，由于重复比较次数太多，极大地增加了犯1类错误的概率，使得结果的可靠性较差。②缺乏动态研究，DN的发展进程中，蛋白质表达是一个高度动态变化的过程，单一个时间点的研究无法获得系统全面的蛋白变化信息。③某些蛋白质组学研究的分辨率太低，导致发现有意义差异蛋白的概率也大大降低，如高糖环境下的系膜细胞研究，虽然采用了亚蛋白质组学方法也只获得了214个蛋白〔7，8〕。本研究采用血浆蛋白质组学技术，应用荧光差异双向凝胶电泳初步筛选出了老年DN患者与正常人群差异表达的血浆蛋白，为下一步进行的前瞻性大规模临床对照研究提供了一定的理论和实践依据。下一步有望通过Western技术在较大人群中进行验证，并确定DN的特异性血浆蛋白标志物。

1 郭晓蕙，楼青青.我国糖尿病教育的问题与思考〔J〕.中华内科杂志，2011；50(1)：6-7.

2 Parving HH，Lewis JB，Ravid M，etal.Prevalence and risk factors for microalbuminuria in a referred cohort of type 2 diabetic patients：a global perspective〔J〕.Kidney Int，2006；69(11)：2057-63.

3 Sharma V，Tikoo K.Stage-specific quantitative changes in renal and urinary proteome during the progression and development of streptozotocin-induced diabetic nephropathy in rats〔J〕.Mol Cell Biochem，2014；388(1-2)：95-111.

4 Zubiri I，Posada-Ayala M，Sanz-Maroto A，etal.Diabetic nephropathy induces changes in the proteome of human urinary exosomes as revealed by label-free comparative analysis〔J〕.J Proteomics，2014；96(2)：92-102.

5 Kim HJ，Cho EH，Yoo JH，etal.Proteome analysis of serum from type 2 diabetics with nephropathy〔J〕.J Proteome Res，2007；6(2)：735-43.

6 Overgaard AJ，Hansen HG，Lajer M，etal.Plasma proteome analysis of patients with type 1 diabetes with diabetic nephropathy〔J〕.Proteome Sci，2010；8(1)：4.

7 Blutke A.Opening a treasure chest：glomerular proteome analyses of formalin-fixed paraffin-embedded kidney tissue in the investigation of diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2012；27(5)：1695-8.

8 Papale M，Di PS，Magistroni R，etal.Urine proteome analysis may allow noninvasive differential diagnosis of diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes Care，2010；33(11)：2409-15.

〔2015-09-25修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

广东省科技厅项目(2012B031800329)

黄 萍(1961-)，女，主任医师，主要从事老年糖尿病研究。

傅明捷(1964-)，女，主任医师，主要从事老年糖尿病及其并发症研究。

R589.1

A

1005-9202(2017)04-0892-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.048

1 广州医科大学实验医学研究中心