转录组测序技术在筛选免疫相关基因中的应用

廖 青 周群丽 唐艳华 黄 锋 许道军

(湖南农业大学动物医学院,湖南长沙 410128)

转录组测序技术在筛选免疫相关基因中的应用

廖 青 周群丽 唐艳华 黄 锋 许道军*

(湖南农业大学动物医学院,湖南长沙 410128)

转录组是细胞或组织内全部的RNA转录本，可以从整体水平上反映细胞中所有基因的表达情况及其调控规律，揭示细胞和组织中的分子构成。转录组测序（RNA-Seq）技术是对转录组进行深度测序的技术。利用RNA-Seq技术对机体免疫相关基因进行筛选，可为进一步研究宿主对抗病原提供新的思路。本文主要对RNA-Seq技术、RNA-Seq测序平台的原理及特点以及RNA-Seq技术在筛选免疫相关基因中的应用做一概述。

RNA-Seq技术 转录组 免疫基因

RNA-Seq是随着高通量测序发展起来的对整个转录组进行分析的方法，即从总RNA中富集出单链mRNA经反转录得到双链cDNA，而后对其进行深度测序分析[1]。RNA-Seq可对任意物种的所有转录本进行检测，通过与基因组进行比对发现差异表达基因，还能发现未知及稀有转录本、可变剪切、cSNP（codingregion single nucleotide polymorphism）、UTR（untranslated region）、内含子边界鉴定等[2]。本文主要对RNA-Seq技术、RNA-Seq测序平台的原理及特点以及RNA-Seq技术在筛选免疫相关基因中的应用做一概述，并对目前RNA-Seq技术目前存在的问题进行了展望。

1 RNA-Seq测序平台

1977年，生化学家Fred Sanger及其同事创建了用DNA聚合酶和双脱氧链终止检测DNA核苷酸序列的技术，即Sanger末端终止法[3]。另外还有传统的链终止法，化学降解法[4]，以及在此基础上发展的各种DNA测序技术统称为第一代测序。第一代测序技术的诞生，为人类在动植物及微生物基因组的研究提供了科学的工具。但是，第一代测序检测通量低且费时费力。因此，随着科技的进步，高通量测序技术即第二代测序技术问世。自2005年以来，主要有三种转录组测序技术平台可用于RNA-Seq测序：ROCH/454 FLX测序技术、 Illumina/Solexa测序技术以及ABI/SOLiD测序技术。由于各测序技术平台的原理及特点有差别，因此我们应了解各高通量测序技术的优缺点根据实验的需要对测序平台进行选择。

1.1 ROCH454 GS FLX测序

2003年，454公司首创了边合成边测序技术，推出一种新的基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统[5]，这为新一代测序技术奠定了坚实的基础。之后，ROCH收购了454公司，在此基础上对测序性能进行改造和优化，于2008年研制出一种更加先进的基因组焦磷酸测序系统——Genome Sequncer FLX System。此测序技术的流程为：①构建测序文库：将样品DNA随机切割成300-800bp的小片段并在两端加锚定接头。② 乳液PCR：1个DNA片段与1个磁珠结合，在一个油包水的微反应器中进行独立扩增。③ GS FLX测序：将带有扩增产物的磁珠放入PTP载板后上机测序，每发生1个碱基配对即产生1个焦磷酸，焦磷酸在ATP硫酸化酶和荧光素酶的作用下产生荧光信号并被配套的仪器实时收集。总的来说，GS FLX的测序流程为：1个片段+1个磁珠=1个读长。

由于454GS FLX测序平台的测序读长长、速度快、通量高、准确率高，可以不需分离细菌直接对不能分离培养的微生物进行研究。解决了复杂微生物群研究过程中的难题。因此，454测序平台在微生物生态学研究中应用最为广泛。

1.2 Illumina Solexa测序

Genome Analyzer IIx是Solexa公司研发的具有“DNA簇”“可逆性末端终结”专利技术的第二代测序仪[6]。2007年被Illumina公司收购，2010年升级优化到Hiseq2000。是目前为止，在各个领域中使用最多的测序平台。此测序技术的流程为：①构建测序文库：将DNA随机打断成200～500bp的片段并在每条打断了的DNA片段两端加上接头。②锚定接头：带接头的DNA片段与测序通道中的单链接头连接。③产生DNA簇：桥式PCR扩增后，测序通道表面生成DNA簇。④单碱基边延伸边测序：在测序通道内加入接头引物、DNA聚合酶以及被荧光标记的dNTP，当碱基延伸时释放荧光信号并收集记录，记录完成后，淬灭荧光信号并进行下一轮测序。

1.3 ABI SOLiD测序

2007年ABI公司推出了SOLiD测序系统。该系统的特点是通过DNA连接酶在连接时对待测样品DNA进行测序，即边连接边测序[7]。此测序技术的流程为：① 构建测序文库：与454测序类似。②乳液PCR：与454测序类似。③边连接边测序：在测序小孔内加入DNA连接酶、引物以及八聚核苷酸探针。此探针的第6--8位碱基带有荧光标记，由于连接法测序是2碱基编码的测序，因此，探针的第1和第2位碱基被DNA聚合酶连接上即发出荧光信号，在荧光信号记录完成后，在探针的第5位后切断荧光信号。之后进行第6和第7位置的测序，每次测序位置相差5位，以此类推至DNA片段末尾。由于通用引物在第二轮测序比第一轮测序前移1位，因此要完成全部位置的测序需要5轮反应。

这种双碱基编码技术以2个碱基对应1个荧光信号，使得每个位点能被检测两次，大大降低了测序的错误率。

1.4 三种测序平台的比较

测序情况分析详见表1。

表1 测序情况分析表

2 RNA-Seq技术简介

转录组是一个细胞或组织内所有转录产物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA和非编码RNA。我们对转录组的研究通常是以mRNA为主。转录组测序（RNA-Seq）技术是最近几年发展起来的获得转录组数据的一项高通量测序技术[1]。与基于杂交的基因芯片技术（DNA microarray或DNA macroarray）、基于标签的基因表达系列分析技术（Serial analysis of gene expression，SAGE）及大规模平行信号测序技术（Massively parallel signature sequencing，MPSS）相比，RNA-Seq技术可以获得任意物种的全基因组序列，能检测到未知基因发现新的转录本。这对未知基因组序列物种的研究尤为重要。葛怡静等人用RNA-Seq技术对黄蜻头部进行了转录组测序分析，发现黄蜻的迁飞与线粒体和代谢活动基因有关。为后续的研究提供了依据[8]。RNA-Seq技术具有高度的灵敏性，可以检测表达量极低的转录本。另外，RNA-Seq技术检测通量高，重复性好[9]。近年来，此技术广泛应用于动植物学研究中，为生命科学研究提供全新的角度。

RNA-Seq技术的流程为：首先提取样品中的总RNA，将RNA富集纯化后片段化处理，再将RNA反转录成cDNA（或先将RNA反转录成cDNA再将cDNA打碎成小片段），然后在cDNA片段两段加上接头，PCR扩增文库。最后利用测序平台获得序列数据。具体流程如图1：

图1 RNA-Seq实验流程图

3 RNA-Seq技术在筛选免疫相关基因中的应用

将测序获得的原始序列信息进行过滤后得到干净序列再生物信息学分析，若待测物种有参考基因组则将RNA-Seq所得到的结果直接与基因组进行比对，若无参考基因组则通过对序列进行拼接、从头组装再进行比对。从而发现新基因、可变剪切、重构转录本优化基因结构、获得基因表达等结果。对基因表达的差异分析，是获得感兴趣基因的重要手段。

当机体被细菌、真菌、病毒、寄生虫等病原体感染后，机体启动体液免疫和细胞免疫的抗感染作用，激活参与机体免疫应答相关信号通路的细胞因子，从而产生免疫应答。有学者对雏鹅和成年鹅的脾脏进行了转录组测序，经过序列比对、GO分析及KEGG分析，发现大量与免疫相关的基因，其中TNFRSF13B、CCL4、CXCR4、TAP2基因表达差异及其显著，为研究鹅免疫系统的分子机制奠定了基础[10]。Gaur等用感染沙门氏菌的猪的脾脏进行转录组测序分析，发现与免疫相关的部分基因显著上调[11]。王慧珂等用RNA-Seq技术对被APEC损伤的雏鸡小肠进行了测序分析，筛选出CCL9、DDX3X、CALB1等与免疫相关的差异基因[12]。为分析宿主抗菌感染的分子机制提供了一定的科学依据。也有学者用RNA-Seq技术对被DHAV-1感染的雏鸭肝脏做了转录组测序分析，研究发现有部分免疫基因表达上调，推测上调的免疫基因可能在抑制病毒在细胞内的复制发挥重要作用，为深入探究DHAV-1的致病机制及雏鸭机体清除病毒的机制奠定了基础[13]。Mu等用RNA-Seq技术对被嗜水气单胞菌感染大黄鱼前后的脾脏做了转录组测序，KEGG分析发现差异显著表达的基因主要集中在Toll- like、JAK-STAT和MAPK等免疫信号通路[14]。Pereiro等采用RNA-Seq技术对免疫刺激后的大菱虾进行转录组测序，KEGG分析在Toll- like受体、补体凝血级联、T细胞受体和B细胞受体等重要的免疫信号通路中得到了很多参与免疫防御的基因[15]。这些基因的发现对研究鱼类的免疫系统及抗病作用有了很大的帮助。因此，利用RNA-Seq技术对机体免疫相关基因进行筛选，可为进一步研究宿主对抗病原提供新的思路。

4 展望

RNA-Seq技术的发展为动植物及微生物转录组学研究提供了新的技术手段，但RNA-Seq能产生非常庞大的数据，如何借助生物信息学对测序数据进行挖掘使其为后续的研究提供最大的价值，是目前来说最大的挑战。相信随着相关学科的发展，RNASeq技术面临的困难也会被解决。

[1] Wang Z，Gerstein M，Snyder M. RNA-Seq：a revolutionary tool for transcriptomics[J].Nat Rev Genet，2009，10（1）：57-63.

[2] 岳桂东，高强，罗龙海，等.高通量测序技术在动植物研究领域中的应用[J].中国科学：生命科学，2012，（2）：107-124.

[3] Sanger F，Nicklen S，Coulson A R. DNA sequencing with chainterminating inhibitors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1977，74（12）：5463-5467.

[4] Maxam A M，Gilbert W. A new method for sequencing DNA[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1977，74（2）：560-564.

[5] Margulies M，Egholm M，Altman W E，et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors[J].Nature，2005，437（7057）：376-380.

[6] Bentley D R，Balasubramanian S，Swerdlow H P，et al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry[J].Nature，2008，456（7218）：53-59.

[7] Smith D R，Quinlan A R，Peckham H E，et al. Rapid whole-genome mutational profiling using next-generation sequencing technologies[J]. Genome Res，2008，18（10）：1638-1642.

[8] 葛怡情，曹玲珍.基于RNA-seq的黄蜻头部转录组测序与分析[J].四川动物，2016，（6）：852-859.

[9] Nagalakshmi U，Wang Z，Waern K，et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing[J]. Science，2008，320（5881）：1344-1349.

[10] Gaur U，Xiong Y Y，Luo Q P，et al. Breed-specific transcriptome response of spleen from six to eight week old piglet after infection with Streptococcus suis type 2[J].Mol Biol Rep，2014，41（12）：7865-7873.

[11] 王惠珂，李少参，祁克宗，等.基于RNA-Seq筛选禽致病性大肠杆菌损伤雏鸡小肠差异表达基因[J]. 中国预防兽医学报，2016（02）：111-115.

[12] 张清瑞.基于RNA-Seq的DHAV-1感染雏鸭的组织转录组分析[D].华中农业大学，2013.

[13] Mu Y，Ding F，Cui P，et al. Transcriptome and expression profiling analysis revealed changes of multiple signaling pathways involved in immunity in the large yellow croaker during Aeromonas hydrophila infection[J].BMC Genomics，2010，（11）：506.

[14] Pereiro P，Balseiro P，Romero A，et al. High-throughput sequence analysis of turbot（Scophthalmus maximus）transcriptome using 454-pyrosequencing for the discovery of antiviral immune genes[J]. PLoS One，2012，7（5）：e35369.