正交试验优化山地五月茶总黄酮的提取工艺

郑丽杰++袁晓强++王恭发++周丹

摘 要 通过单因素试验，分析乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比、提取次数等对总黄酮提取率的影响，采用正交试验确定山地五月茶总黄酮的最佳提取工艺。结果表明，山地五月茶总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度85%、料液质量体积比1∶10、提取温度90℃，加热回流提取2.0 h，提取3次。在此条件下，测得山地五月茶总黄酮的含量为（4.548 6±0.041 5）mg/g。本研究建立了山地五月茶总黄酮的提取工艺，可为山地五月茶资源的充分利用、研究开发等提供科学依据。

关键词 山地五月茶 ；总黄酮 ；正交试验

中图分类号 TQ464 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.018

Optimization of Extraction Technology for Total Flavonoids from

Antidesma montanum Using Orthogonal Experiment

ZHENG Lijie1） YUAN Xiaoqiang2） WANG Gongfa1） ZHOU Dan1）

（1 School of Pharmacy， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199；

2 Pharmacy Department， Xiantao First People's Hospital， Xiantao， Hubei 433000）

Abstract Total flavonoids were extracted from Antidesma montanum by using single-factor experiment to determine the effect of ethanol concentration， temperature， duration of sample extraction， solid-liquid ratio and extraction times on the extraction ratio of total flavonoids. An orthogonal experimental design was arranged to optimize the technology for extraction of the total flavonoids from A. montanum . The results showed that the optimal condition for extracting total flavonoids from A. montanum was as follows： 5% ethanol， solid-liquid ratio of 1∶10， temperature 90℃， and heat reflux extraction for 2 h and 3 times. Under the optimal condition， the total flavonoids content extracted from A. montanum was （4.548 6±0.041 5） mg/g. An optimal technology for extraction of total flavonoids from A. montanum was hence established， which would provide scientific data for further research， development and utilization of A. montanum germplasm resources.

Keywords Antidesma montanum ； total flavonoids ； orthogonal experiment

黄酮类化合物又称生物类黄酮，是分布广泛的次生物质。黄酮类化合物有许多有益的生物学活性，如抗癌、镇痛、抗炎抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、消除自由基等，能提高机体免疫力，对消化呼吸系统疾病有治疗作用[1-2]，可广泛用于医药、食品及化妆品等领域[3]。

山地五月茶（Antidesma montanum），是大戟科（Euphorbiaceae）五月茶屬（Antidesma）植物，主要产于广东、海南、广西等省区[4]。五月茶属植物通常以根、叶、茎入药，具有很好地药理活性和开发前景。民间常用于治疗眼疾[5]。目前，国内外对山地五月茶的化学成分研究表明，山地五月茶含有黄酮类、甾萜类、生物碱类等化合物[6-8]。目前尚未见有关山地五月茶中黄酮的研究报道。本研究采用溶剂提取法提取山地五月茶总黄酮，利用正交试验优化设计山地五月茶总黄酮的提取工艺条件，并测定山地五月茶中总黄酮的含量，为山地五月茶黄酮类产品的研究开发和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

山地五月茶采自海南省万宁市兴隆县，经海南医学院中药学教研室曾念开老师鉴定为山地五月茶。

1.1.2 仪器与试剂

仪器：UV-1800C型紫外-可见分光光度计（上海凤凰仪器有限公司）；800B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；AE-100型电子分析天平（南京庚辰科学仪器有限公司），FW100高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

试剂：芦丁对照品（批号100080，中国食品药品检验研究院）、无水AlCl3（天津市福晨化学试剂厂）、三水合乙酸钠（西陇化工股份有限公司）、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙酸均购自广州化学试剂厂，试剂级别为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 样品溶液的制备

称取2.000 0 g干燥的山地五月茶粉末于100 mL圆底烧瓶中，加入95%乙醇20 mL，80℃下加热回流提取2 h，离心过滤，提取3次，合并滤液，用95%乙醇定容至100 mL，摇匀，即得山地五月茶样品溶液。

1.2.2 总黄酮的测定

采用 AlCl3显色法测定山地五月茶总黄酮的含量[9]。

1.2.3 标准曲线的绘制

精密称取105℃下干燥至恒重的芦丁对照品0.020 40 g，用无水乙醇溶解，定容至100 mL，摇匀，得0.204 0 mg/mL的芦丁标准溶液。

分别吸取芦丁标准溶液0、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.2、1.3 mL于10 mL容量瓶中，加入3.20 mL 1.5% AlCl3，并用pH 5.5的NaAc-HAc缓冲液定容，摇匀。常温下显色反应20 min后，在415 nm波长处测定吸光度。

1.2.4 样品中总黄酮含量的测定

准确移取样品溶液1.00 mL于10 mL容量瓶中，按1.2.3进行显色、测定。根据线性方程计算样品中总黄酮的含量。

1.2.5 单因素试验

1.2.5.1 乙醇浓度对提取效果的影响

精密称取2 g山地五月茶粉末5份，分别加入不同浓度的乙醇溶液20 mL（60%、70%、80%、90%、无水乙醇），80 ℃加热回流提取2 h，离心过滤，提取3次，合并滤液，定容至100 mL，摇匀。按1.2.3方法测定样品的吸光度。

1.2.5.2 提取温度对提取效果的影响

精密称取2 g山地五月茶粉末5份，加入90%的乙醇溶液20 mL，分别在50、60、70、80、90 ℃条件下加热回流提取2 h，离心过滤，提取3次，合并滤液，定容至100 mL，摇匀。按1.2.3方法测定样品的吸光度。

1.2.5.3 提取时间对提取效果的影响

精密称取2 g山地五月茶粉末5份，加入90%的乙醇溶液20 mL，在90℃下分别加热回流提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，离心过滤，提取3次，合并滤液，定容至100 mL，摇匀。按1.2.3方法测定样品的吸光度。

1.2.5.4 料液比对提取效果的影响

精密称取2 g山地五月茶粉末5份，分别加入12、16、20、24、28 mL的90%乙醇溶液（料液质量体积比分别为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14），在90℃下加热回流提取2 h，离心过滤，提取3次，合并滤液，定容至100 mL，摇匀。按1.2.3方法测定样品的吸光度。

1.2.5.5 提取次数对提取效果的影响

精密称取2 g山地五月茶粉末5份，加入90%的乙醇溶液20 mL，在90 ℃条件下分别加热回流提取1、2、3、4次，每次2 h，离心过滤，合并滤液，定容至100 mL，摇匀。按1.2.3方法测定样品的吸光度。

1.2.6 正交试验

根据单因素结果，以样品的吸光度为综合考察指标，选定提取温度、乙醇浓度、料液比、提取时间4因素3水平，进行正交试验设计（表1），优化山地五月茶总黄酮的提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。线性方程为A=0.031 7c-0.011 8，相关系数r =0.999 6。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 乙醇浓度对提取效果的影响

由图2可以看出，随着乙醇浓度的增加，山地五月茶总黄酮的提取率也越高。当乙醇浓度为90%时，总黄酮提取率达到最大。之后，随着乙醇浓度的增加，总黄酮提取率明显下降。黄酮类化合物种类繁多，结构复杂，其溶解度会因结构、存在状态及提取溶剂极性不同而有所差异。由图2可以看出，乙醇的浓度不宜过高或过低。浓度过低，提取率下降，浓度过高会增加生产成本。因此选定85%、90%和95%作为正交试验的3个水平。

2.2.2 提取温度对提取效果的影响

由图3可知，山地五月茶总黄酮提取率随温度升高而增加；当提取温度为90℃时，样品中总黄酮提取率最高。为了保证实验的安全，温度不宜继续升高。因此，选定80、85、90℃作为正交试验的3个水平。

2.2.3 提取時间对提取效果的影响

由图4可知，随着提取时间的增加，总黄酮提取率逐渐增高。可见反应时间越长，提取越充分。当提取时间为2 h时，总黄酮提取率基本稳定。之后，提取时间的变化对总黄酮提取率影响不大。因此，选择提取时间为1.5、2.0和2.5 h作为正交试验的3个水平。

2.2.4 料液比对提取效果的影响

由图5可知，总黄酮提取率随着料液比的增加而逐渐增高。料液比越大，提取溶剂的用量越多，有利于总黄酮的提取。当料液质量体积比为1∶10时，总黄酮提取率基本稳定。之后，料液比的变化对总黄酮提取率基本无影响，这意味着总黄酮已提取完全，继续增加料液比会造成试剂的浪费。因此，选定料液质量体积比为1∶8、1∶10、1∶12作为正交试验的3个水平。

2.2.5 提取次数对提取效果的影响

由图6可知，随着提取次数的增加，总黄酮提取率有所增加。提取次数达到3次以上时，总黄酮提取率变化缓慢，当提取4次时，达到最大值。实验中对总黄酮的提取次数为3次。

2.3 正交试验结果

结合单因素试验的结果，对山地五月茶总黄酮的提取工艺进行正交试验设计（表2）。正交试验结果如表2。

由表2、3可以看出，不同因素对山地五月茶总黄酮提取率的影响不同；极差的大小显示了影响因素的主次，各因素对总黄酮提取率的影响大小依次为：提取温度（A）>乙醇浓度（B）>料液比（C）>提取时间（D）；提取温度（A）和乙醇浓度（B）对山地五月茶总黄酮提取率有显著的影响。

综合单因素试验和正交试验结果分析，山地五月茶总黄酮的最佳提取条件是A3B2C2D2，即乙醇浓度85%、料液质量体积比1∶10、提取温度90℃，加热回流提取2 h，提取3次。

2.4 样品中黄酮总含量的测定

为进一步考察山地五月茶总黄酮的最佳提取条件的稳定性，依据最佳提取条件，对山地五月茶样品进行提取、显色、测定，平行测定3次。结果表明，山地五月茶中总黄酮的含量为（4.548 6±0.041 5）mg/g，相对标准偏差为1.38%。

3 结论

本研究对山地五月茶总黄酮的提取工艺进行研究。通过单因素试验和正交试验设计，得到山地五月茶总黄酮的最佳提取条件为：乙醇浓度85%、料液质量体积比1∶10、提取温度90℃，加热回流提取2 h，提取3次。在此条件下对山地五月茶总黄酮进行提取、显色、测定，测得山地五月茶总黄酮的含量为（4.548 6±0.041 5）mg/g。

本研究建立的山地五月茶总黄酮的提取工艺，具有操作简单，提取时间短，提取率高，绿色环保等特点。本研究将为山地五月茶资源的充分利用、研究开发等提供科学依据。同时，以乙醇为溶剂对总黄酮进行提取，整个过程中无污染、易回收和循环利用，是较为理想的提取方法。

參考文献

[1] 帕塔尔·尼牙孜，邱远金，王婷媛，等. 正交实验优化新疆沙棘果渣总黄桐的提取工艺[J]. 西北药学杂志，2016，31（2）：119-121.

[2] 左丽丽，赵 路，雷丽丽，等. 正交实验法优化西兰花总黄酮提取工艺研究[J]. 吉林医药学院学报，2016，37（4）：245-248.

[3] 陈 园. 正交试验优化紫荆果总黄酮提取及其抗氧化性[J]. 山东农业大学学报（自然科学版），2016，47（1）：43-46.

[4] 云南省药材公司. 云南中药资源名录[M]. 北京：科学出版社，1993：277.

[5] 周 丹，艾朝辉，韩 丽. 山地五月茶挥发油的化学成分分析[J]. 时珍国医国药，2012，23（1）：65-66.

[6] 周 丹，韩 丽，林连波，等. 山地五月茶化学成分预试研究[J]. 中国医药导报，2011，8（13）：37-38.

[7] 韩 丽，刘月丽，王小蒙，等. 山地五月茶急性毒性及抗炎作用试验研究[J]. 时珍国医国药，2012，23（6）：1 391-1 393.

[8] 周 丹，张万科，赖伟勇，等. 山地五月茶微量元素含量的测定[J]. 海南医学院学报，2012，18（3）：308-309.

[9] 何书美，刘敬兰. 茶叶中总黄酮含量测定方法的研究[J]. 分析化学研究简报，2007，35（9）：1 365-1 368.

① 基金项目：海南省大学生创新项目（No.20140096）；海南医学院大学生创新项目（No.HYCX201336）。

收稿日期：2016-10-30；责任编辑/古小玲；编辑部E-mail： rdnk@163.com。

② 郑丽杰（1994～），女，汉族，本科在读。

③ 通讯作者：周 丹（1981～），女，副教授，硕士，研究方向为植物化学成分分析，E-mail： zhoudan1014@126.com。