AcMNPV p95基因一段339bp序列在病毒复制中的作用

朱明骏，尹 隽，钟 江

(复旦大学 生命科学学院 微生物学与微生物工程系 上海 200438)

杆状病毒(Baculovirus)是一类在自然界中仅感染节肢动物的病毒，在分类上属于杆状病毒科，基因组为90～160kb的双链环状DNA[1]．已报道的杆状病毒有500多种，其中苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是杆状病毒的模式种，其基因组大小为133894bp，包含154个潜在的开放阅读框(ORF)[2]．

AcMNPVp95基因由第83号开放阅读框编码，又称为ac83．它编码一个含847个氨基酸残基的蛋白质[2-3]．研究表明该蛋白是病毒核衣壳的组成蛋白[4-5]，同时也是病毒经口感染因子(Per os Infectivity Factor, PIF)复合体的组成部分，与病毒经口感染昆虫有关[6-7]．P95蛋白有一个几丁质结合结构域，删除该结构域后，病毒无法经幼虫中肠感染，但可以经血腔注射感染[7]．

本实验室早期的研究结果表明，虽然p95基因破坏后病毒无法在Sf9细胞中复制，但编码P95蛋白N端序列的1kb基因序列对于病毒的复制是非必需的[8]．Zhu等[7]研究表明，在p95基因敲除的病毒基因组中回补451～600位氨基酸残基对应的450bp基因序列后，就能部分恢复病毒在Sf9细胞中复制和产生子代病毒的能力，但其效价仍仅100 TCID50/mL左右，大大低于正常情况．

本研究构建了2株不能表达p95基因但带有对应P95蛋白565～677位氨基酸的一段339bp核心序列的重组病毒，证实重组病毒可以在Sf9细胞中完成复制，且重组病毒复制水平接近野生型病毒．这项研究进一步明确了p95基因核心区域的位置，并为研究其作用机制提供了基础．

1 材料与方法

1.1 细菌、细胞和病毒

大肠杆菌EscherichiacoliTG1，DH10B等菌株，Spodopterafrugiperda细胞系Sf9由本实验室保存．Sf9细胞用TNM-FH培养基(Sigma-Aldrich, MO, USA)补充10%的小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素在27℃培养．表达增强型绿色荧光蛋白基因egfp的重组病毒AcEGFP由本实验室保存，用来代表的能够完全复制的野生型病毒．

1.2 质粒的构建

注： 加下划线部分为AvrⅡ酶切位点．

根据实验室研究结果，选取p95基因核心区域的DNA序列(339bp，AcMNPV基因组位置： 69576～69914bp，以下称为Core339)，用339upper/339lower引物对(表1)进行PCR扩增，PCR产物T载体克隆后，经序列分析验证，获得两端带有AvrⅡ识别位点的p95基因核心片段Core339．将在pFastbac1质粒的多克隆位点插入egfp基因的质粒pBG[9]用AvrⅡ酶切，并连接到用AvrⅡ酶切的Core339上，得到Core339片段以正、反两种方向分别插入pFastbac1 SV40 polyA信号序列后的两种重组转移质粒pFastbacEGFP/Core339+和pFastbacEGFP/Core339-．质粒经PCR和酶切检验正确．另将ie1启动子带动的egfp片段插入pFastbac1质粒多克隆位点的HindⅢ处，得到转移质粒pFastbac-ie1EGFP．

1.3 重组Bacmid的构建

首先利用λ-red系统[10]以阿普拉霉素抗性基因(apra)置换p95基因的大部分区域，敲除p95基因．p95基因位于基因组67884～70427bp处，本实验中敲除的区域为68001～70427bp，仅保留了p95从起始密码子起的117bp．根据生物信息学分析，该区域可能是位于p95基因上游(反向)的AcTLP基因的启动子[11]．通过PCR扩增apra基因，使得到的扩增产物在两端分别带有39bp和57bp与敲除区域两侧分别同源的序列．将表达λ-red重组酶的pKD46质粒转入Bac-to-Bac菌株DH10Bac，得到DH10Bac/pKD46，再转入上述带有同源序列的apra基因PCR产物，筛选对阿普拉霉素(40μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)同时具有抗性的重组菌．用试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取Bacmid DNA，PCR检验确认p95基因已经被敲除．将Bacmid DNA通过电转化转入E.coliDH10B，随后转入带有Tn7转座酶的辅助质粒pMON7124，得到E.coliDH10Bac-bP95K/helper.

按照Bac-to-Bac技术手册(Invitrogen)，用以上构建的3种转移质粒转化DH10Bac-bP95K/helper，筛选得到相应的重组Bacmid bP95K/Core339/EGFP+，bP95K/Core339/EGFP-和bP95K/EGFP．通过PCR扩增对这些Bacmid进行验证．

1.4 重组Bacmid转染Sf9细胞

Sf9细胞接入24孔细胞培养板，2×105/孔．培养过夜后，用重组Bacmid DNA转染．细胞转染利用Cellfectin Ⅱ(Invitrogen)按产品说明书进行．在转染后一定时间用荧光显微镜(Olympus CKX41)观察感染情况．转染后一定时间悬浮细胞，离心后收获上清，用终点稀释法测定重组病毒效价．

1.5 重组病毒感染Sf9细胞

Sf9细胞接入24孔细胞培养板，2×105/孔．培养过夜后，用一定量重组病毒感染，使MOI约为5pfu/cell．感染后一定时间悬浮细胞，离心后收获上清，用终点稀释法测定重组病毒效价．

1.6 感染细胞中病毒DNA拷贝数的测定

Sf9细胞用重组病毒感染(MOI=5 pfu/cell)，感染后不同时间收集细胞，用PBS离心清洗(3000r/min，5min)后，细胞沉淀加入20μL水，80μL 0.4% SDS(TE配置)，5μL 20mg/mL的蛋白酶K(Roche)，1μL RNase(1000×).50℃消化5～8h．酚/氯仿/异戊醇抽提2～3次后，用无水乙醇沉淀总DNA．DNA拷贝数测定使用SYBR©Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)定量PCR预混液(TaKaRa)进行，引物为gp64upper/gp64lower(表1)．Real-time PCR使用Stratagene Mx 3000p进行，Ct值用以2-ΔΔt法进行相对定量，以同一样本2h时为1．

1.7 SDS-PAGE电泳和Western blot检测P95蛋白表达

转染后72h收获细胞，3000r/min离心5min．细胞沉淀用PBS离心清洗后，加入50μL样品缓冲液，100℃煮沸5min．样品进行12% SDS-PAGE电泳和电转移．用Western blot检测P95蛋白的表达，一抗用鼠源P95多克隆抗体(实验室自制)，二抗为AP偶联抗鼠IgG抗体(Sigma-Aldrich)，用BCIP/NBT显色．

2 结果

2.1 重组Bacmid的构建

根据前期研究结果[7-8]和实验室初步数据(尹隽等，未发表)，将p95基因中一段339bp的序列(Core339，位于AcMNPV基因组69576～69914，对应P95蛋白565～677位氨基酸)以正反两个不同的方向插入转移质粒pFastbacEGFP报告基因egfp编码区及多聚腺苷信号(SV40 PA)下游，得到转移质粒pFastbacEGFP/Core339+和pFastbac/Core339-．这两个质粒中egfp基因位于多角体启动子下方，所插入的Core339上下游没有明显的启动子．另外将ie1启动子驱动egfp基因的片段插入pFastbac1多克隆位点，得到pFastbac-ie1EGFP．

通过λ-red方法用阿普拉霉素抗性基因(apra)置换病毒基因组Bacmid中p95基因的绝大部分序列，得到p95基因缺失且多角体位点空白，可以转入其他基因的Bacmid bP95K．将上述转移质粒转入带有bP95K和Tn7转座酶表达质粒的大肠杆菌，通过Bac-to-Bac获得重组Bacmid bP95K/EGFP/339+，bP95K/EGFP/339-，和bP95K/EGFP．它们在p95基因位点和多角体基因位点的结构如图1(a)所示．

图1 重组Bacmid p95基因位点和多角体基因位点结构示意图(a)及构建结果的PCR扩增验证(b)Fig.1 The diagram of recombinant Bacmid in p95 and polyhedrin locus (a) and the verification of construction results by PCR method(b)

通过PCR扩增验证重组Bacmid的正确性，结果如图1(b)所示．用p95基因上下游引物(p95upper/p95lower，表1)进行PCR扩增，作为对照的p95野生型Bacmid bAcEGFP的扩增得到2.5kb片段，而p95基因缺失的3个重组Bacmid中都只能扩增得到1.5kb的片段．用Core339上下游引物(339upper/339lower，表1)进行PCR扩增，除了bP95K/EGFP未得到扩增产物外，其余3种Bacmid均得到339bp的片段．用BacmidF引物与339upper进行PCR扩增，仅bP95K/EGFP/339-有3.1kb的扩增产物，而用BacmidF引物与339lower进行PCR扩增，仅bP95K/EGFP/339+有3.1kb的扩增产物．以上结果均与预期一致，表明3种Bacmid构建正确．

2.2 带有Core339的重组病毒的获得

用Bacmid bP95K/EGFP、bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-转染Sf9细胞，120h后在荧光显微镜下观察，结果如图2所示．其中bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-转染的细胞中已有明显的感染扩散现象，表明病毒复制已经启动，而bP95K/EGFP仅个别细胞可以观察到荧光．取转染上清测定病毒效价，bP95K/EGFP效价低于100 TCID50/mL，虽经病毒传代培养，未能得到有感染力的病毒，与以前的报道一致[7]．bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-转染上清液中的病毒效价均达到1.0×104TCID50/mL左右，传代培养后效价进一步提高，由此得到了重组病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-．为确保重组病毒确实为仅带有Core339的p95基因缺陷型，从感染细胞上清中提取了病毒DNA，进行PCR扩增验证，得到肯定的结果(未显示)．

图2 带有p95基因Core339片段的重组杆状病毒感染Sf9细胞120h后的荧光显微镜图Fig.2 The fluorescence microscopy pictures of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus containing Core339 fragment of p95 gene(120hpi)

图3 重组病毒感染的Sf9细胞中P95蛋白的Western blot 检测Fig.3 Western blot analysis of P95 expression in Sf9 cells infected with recombinant virus

进一步检测的重组病毒感染细胞中P95蛋白的表达情况，结果如图3所示．可见仅有p95野生型的对照有完整的P95蛋白表达，vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-感染的细胞中均未检测到条带，这也证明得到重组病毒的p95基因已经被敲除而无法表达．

2.3 带有Core339片段的重组杆状病毒的复制动态

用vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-感染Sf9细胞(MOI=5 pfu/cell)，在感染后不同时间测定培养中病毒的效价，以p95基因为野生型的AcEGFP病毒作为对照，结果如图4所示．由图可见，带有Core339片段的重组病毒产生出芽型病毒的时间明显晚于AcEGFP，但120h后效价趋于接近．其中，vP95K/EGFP/339-在96h已经达到与AcEGFP一致的水平，而vP95K/EGFP/339+复制较慢一些，但120h时效价仍达1.0×107TCID50/mL左右．进一步测定重组病毒基因组DNA的复制情况，如图5所示．可以发现，感染后12h和18h，重组病毒基因组拷贝数明显低于AcEGFP，但到24h时，3种病毒病毒基因组拷贝数接近．

3 讨 论

P95蛋白及其同源蛋白是多种杆状病毒的结构蛋白，也与病毒感染昆虫活体有关[12-13]．但同时，有研究表明完整的P95蛋白对于AcMNPV在体外培养的细胞中复制是非必需的．本实验室2008年曾报道剔除P95 N端的300多个氨基酸对病毒在Sf9细胞中的复制无明显影响[8]．Zhu等[7]的结果也表明，编码P95蛋白451～600位氨基酸的DNA片段(450bp)可以部分弥补p95基因缺失的影响，使病毒部分获得产生子代病毒的能力[7]，但其效价仅为100 TCID50/mL左右．

图4 重组病毒感染Sf9细胞后培养液中病毒效价Fig.4 Virus titers in the culture of Sf9 cells infected with recombinant virus

图5 Sf9细胞中病毒DNA复制动态Fig.5 Replication dynamics of viral DNA in Sf9 cells infected with recombinant virus

本研究在实验室前期工作的基础上，进一步把对病毒复制起关键作用的片段定位到一段339bp的片段上．用该片段构建的重组病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-都能得到高效价的重组病毒，效价水平与p95基因正常的病毒AcEGFP基本相当．Western blot实验未能在这两株病毒感染的细胞中检测到P95蛋白，结合PCR检测，证实这两株病毒中的p95基因编码区的大部分确已被置换而无法表达．同时，病毒复制动态分析表明，这两株病毒无论在病毒DNA复制还是在出芽型病毒产生方面均稍慢于AcEGFP，vP95K/EGFP/339+在产生出芽型病毒方面又慢于vP95K/EGFP/339-，但DNA拷贝数在感染后24h，病毒效价在感染后120h时均与AcEGFP趋于一致．这些结果表明完整的P95蛋白对于病毒的复制不是必需的，其核心区域Core339对病毒的复制有关键的作用．同时也提示P95蛋白在病毒复制中仍发挥一定的作用．

Core339片段对应P95蛋白的565～677位氨基酸，与Zhu等[7]报道的451～600位氨基酸的结果有所重叠，但不尽一致．这应该是两个研究中病毒效价差异的关键．我们前期的系列共转染实验发现进一步缩短这个段序列会显著降低病毒复制的水平，但相关结果还需要通过以构建重组病毒进一步验证．Zhu等报道了带有451～600区域的重组病毒(vAc83: del2-450/601-847)感染细胞后可检测到与正常水平相当的截短型P95蛋白的表达，但本研究中，我们并未检测到相应的条带．这可能与Core339片段更小，其潜在表达的蛋白的分子质量较小、不易检测有关．

在前期实验中，我们曾尝试将Core339的PCR片段、质粒、体外转录RNA(正向和反向)等与p95缺陷的bP95K/EGFP共转染细胞，均观察到病毒不同程度的复制(结果未显示)．本研究验证了这些结果的可靠性．值得注意的是，在本研究所构建的两株重组病毒中，Core339插入位置两侧，一侧是SV40 polyA信号序列，另一侧是Tn7转座子序列，没有明显的启动子序列，而Core339片段以正向或反向插入都可以获得病毒．因此，Core339片段是如何发挥作用的，值得探究．我们曾尝试检测该片段可能的转录产物，并没有得到明确的结果．此外，我们在研究病毒感染的细胞中microRNA动态时发现microRNAbantam是Sf9细胞中丰度最高的microRNA之一，对于病毒的感染和基因表达有一定作用[14]．序列比对发现Core339与bantam序列有明显的同源性，似乎提示Core339可能参与干扰宿主microRNA的活性．但我们初步的研究未能得到明确支持这一假说的结果．

综上，本研究的结果提示p95基因中的一段339bp的核心序列对病毒的复制具有关键作用，但它是如何发挥作用的还有待深入研究．

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