隐性乳房炎患牛乳中病原菌的分离与鉴定

刘鸽，范子仪，张培生，杨慧敏，屈勇刚

(石河子大学动物科技学院，石河子 832003）

隐性乳房炎患牛乳中病原菌的分离与鉴定

刘鸽，范子仪，张培生，杨慧敏，屈勇刚

(石河子大学动物科技学院，石河子 832003）

乳房炎是奶牛的一种常见性疾病，一般分为临床型乳房炎和隐性乳房炎两类。由于隐性乳房炎症状轻微，常被人们所忽视，不仅严重影响患牛的产奶量、乳品质，推迟产后发情和妊娠时间，而且易在牛群中传播，给奶牛业造成严重损失，同时牛奶品质发生变化，还会危及人类健康。因此，积极预防控制奶牛隐性乳房炎的意义十分重大。本研究从隐性乳房炎患牛的乳汁中分离鉴定出沙雷氏菌、葡萄球菌和大肠杆菌，同时对隐性乳房炎患牛的乳汁进行了微生物多样性分析，旨在为奶牛临床型乳房炎及隐性乳房炎的防治提供理论基础。

隐性乳房炎；分离鉴定；多样性；防治

奶牛乳房炎是奶牛乳腺受到外界的综合刺激（物理、化学、微生物方面）后而发生的一种炎性反应，是奶牛场中最常见、经济损失最为严重的疾病之一，几乎每个牛场中都存在，其中半数以上为隐性乳房炎，是造成经济损失的主要原因。奶牛隐性乳房炎又称亚临床型乳房炎(Nonclinical or subclinical mastitis)，其特征是无可见的临床症状，乳汁感官无可见变化，但乳汁在理化性质、细菌学上已发生改变。由于隐性乳房炎的乳汁无肉眼可见异常变化，乳房不出现或仅轻微出现发热、肿胀、疼痛等症状，所以常被人们所忽视，对奶牛业、乳品业的发展及消费者健康有着严重的危害[1]。

在奶牛场生产中，隐性乳房炎的感染率和发病率都比较高，是导致暴发临床型乳房炎的最主要因素，给奶牛养殖企业造成的经济损失也最为明显的，常是临床型乳房炎损失的2倍，甚至更多。据报道，在美国，26.5%被淘汰奶牛患有乳房炎；在芬兰、挪威和瑞典等国，因为乳房健康问题而被淘汰的奶牛分别占35%、19%和22%[2]。隐性乳房炎患牛的产奶量随感染程度的加剧，乳汁中体细胞数量随之增多[3]。根据感染程度不同，病牛每天可少产奶2～4kg[4]。据NMC（美国国家乳房炎委员会）报道[5]，隐性乳房炎患牛的每个感染乳区，在泌乳期少产奶636～773kg。细菌性致病因素常被分为两大类：接触传染性病原微生物和环境性病原微生物。病原微生物主要包括无乳链球菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌[6,7]。因此，通过对隐性乳房炎患牛乳汁中的细菌分离鉴定，确定引起奶牛隐性乳房炎主要的细菌种类，并对隐性乳房炎奶牛乳汁中微生物的多样性进行分析，旨在为奶牛临床型乳房炎及隐性乳房炎的防治提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集

从石河子周边某个规模化奶牛场的18头隐性乳房炎患牛乳房中采集18个乳样，依次编号1～18。按照LMT的检测标准取样检测，并按LMT的判定标准进行判定。选取LMT检测阳性牛，无菌采集每个乳头的奶样品10mL，置无菌采样瓶中加盖密封后用冰袋冷冻保存。样品带回实验室放-20℃冰箱保存备用。经LMT普查、筛选，判断隐性乳房炎阳性乳样品，供实验室细菌分离与鉴定。

1.1.2 试剂及培养基

兰州奶牛乳房炎检测试剂（LMT），营养琼脂培养基（NA），三糖铁斜面培养基，柠檬酸盐培养基，甘露醇培养基。

1.2 方法

1.2.1 细菌富集

将采集的乳样首先进行细菌富集：先摇匀乳样，无菌取适量乳样加入到灭菌普通营养肉汤培养基中，37℃摇床培养12h，观察结果。

1.2.2 细菌的分离鉴定与纯化

将富集的菌液分别在普通琼脂平板培养基上划线接种，置37℃温箱温育24h，然后观察菌落的形态，及时挑取具有典型特征的菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。根据菌体形态和染色特性判定细菌的类属，再经纯化培养，最后作出判断。

1.2.3 细菌生化鉴定

待检细菌经分离培养后，分别进行甲基红试验（M.R），DNA酶试验，接种三糖铁斜面、柠檬酸盐、吲哚、V-P、甘露醇、葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖培养基中，37℃培养12～48h，观察试验结果。

2 结果

2.1 菌株富集

从采集的18份乳样中分别取适量乳样加入到已灭菌的普通营养肉汤中进行细菌富集，如图1所示。

图1 细菌富集

2.2 菌株分离鉴定与纯化

菌液经12h摇床培养后，在普通琼脂培养基上划线培养，分离菌株形成三种不同形态的菌落。第一种菌落呈红色，不透明，边缘圆整，表面光滑、隆起呈金属光泽，色素不扩散到培养基中，及直径为1.0～1.5mm（图2）；涂片、革兰氏染色镜检，可见革兰氏阴性、红色、两端钝圆的直杆状菌（图3）。第二种菌落为小圆形，边缘整齐表面光滑，湿润，有隆起，呈白色，不透明，直径为1.0～2.0mm（图4）；涂片、革兰氏染色后镜检，可见革兰氏阳性、紫色、圆形或卵圆形球菌（图5）。第三种菌落是乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致，半透明，有小凸起，直径为1.0～1.5mm（图6）；涂片、革兰氏染色后镜检，可见革兰氏阴性、红色、两端钝圆的短杆状菌（图7）。

图2

图3

图4

图5

图6

图7

2.3 菌株生化鉴定

挑选第一种分离菌的8组菌株进行试验。其中，8个组甲基红（M.R）反应变为黄色，呈阴性；7个组V-P反应变红色呈阳性；7个组吲哚反应变为红色，为阳性；8个组可发酵并利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇和柠檬酸盐产酸，有的能产气，7个组不能分解乳糖；8个组DNA酶试验反应均为阳性。该试验结果符合沙雷氏菌的生化鉴定特征。

挑选第二种分离菌的8组菌株进行试验。8个组均可分解葡萄糖、麦芽糖，1个组不能分解乳糖、蔗糖和甘露醇；8个组在三糖铁斜面产酸不产气；7个组甲基红（M.R）反应变为红色呈阳性；7个组V-P反应为红色呈阳性；7个组DNA酶试验反应为阳性。该试验结果符合葡萄球菌的生化鉴定特征。

挑选第三种分离菌的8组菌株进行试验。7个组在三糖铁斜面能产气、产酸，不生成硫化氢；8个组可分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖和甘露醇，2个组不能分解蔗糖；7个组甲基红（M.R）反应变为红色呈阳性；7个组V-P反应不变色为阴性；6个组吲哚反应变为红色为阳性；7个组柠檬酸盐反应没有发生变色现象，判为阴性。该试验结果符合大肠杆菌的生化鉴定标准特征。

2.4 乳样中病原菌的分布

表1 病原菌在各乳样中的存在情况

样品1～18中，只有8、12号样品中含有大肠杆菌、沙雷氏菌和葡萄球菌中的一种菌；6、10和15号都含有大肠杆菌、沙雷氏菌和葡萄球菌，其余样品含有大肠杆菌、沙雷氏菌和葡萄球菌中的两种。大肠杆菌和葡萄球菌在各样品中的检出率均为77.78%（14/18)，沙雷氏菌的检出率为50.00%（9/18）。

3 讨论

本试验从采集的乳样中分离出了三种菌株，通过形态学观察、生化特性分析对其进行鉴定，最终确定为大肠杆菌、沙雷氏菌和葡萄球菌。

试验结果显示，隐性乳房炎乳样含有葡萄球菌、大肠杆菌和沙雷氏菌等多种细菌，奶牛乳房炎常由2～3种甚至3种以上的病原菌引起的。张玉玲[8]等人2014年从银川市某规模化奶牛场的40头隐性乳房炎患牛的乳样中检出金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌。林源[9]等人研究发现，在隐性乳房炎患牛的乳样中检出金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌、犬链球菌、其他链球菌、大肠杆菌、牛棒状杆菌。

在自然状态下，乳房细胞在一定程度上能防御病原微生物的侵害[10]。但由于某些因素造成奶牛乳头受损或在奶牛机体发生比较严重感染时，机体的防御平衡就会被打破，病原微生物就会趁机入侵，或原来寄居于乳房内的条件性病原微生物开始活化，并大量增殖而使乳房致病。大多数奶牛场只重视临床型乳房炎，只要发现就及时治疗，但对隐性乳房炎的危害性认识不足。搞好奶牛乳房炎的防治工作是一项非常重要的长期工作，必须引起奶牛场工作人员的高度重视。

[1] 储明星,石万海,邝霞,等.奶牛乳房炎与经济性状之间的关系研究进展[J].中国畜牧杂志,2002,38(5):44-45.

[2] 李勇,葛秀国.奶牛隐性乳房炎研究进展[J].黄牛杂志,2003, 29:38-41.

[3] 魏学良,张家骅.重庆地区奶牛隐性乳房炎的调查[J].黄牛杂志,2003,(6):15-21.

[4] 李国江,邹风驰.奶牛隐性乳房炎的监测与评估[J].中国奶牛, 1998,(3):16-17.

[5] Lund T. F, Miglior. J. C. M Dekkers and E B, Burnside Genetic relationships between clinical mastitis， somatic cell count， and udder conformation in Danish Holsteins[J]. Livest Prod Sci, 1994, 39:243-251.

[6] 威廉.C.雷布汉.赵德明,沈建忠,译.奶牛疾病学.第八版[M]. 北京:中国农业大学出版社,1999,35-51.

[7] 王印魁. 奶牛隐性乳房炎的发病原因及综合防制[J].中国乳业,2007,11:53-56.

[8] 张玉玲,吴亚文,李志红,等. 某规模奶牛场奶牛隐性乳房炎致病菌的检测及药敏试验[J]. 黑龙江畜牧兽医,2015,8:99-100.

[9] 林源,何生虎,李生虎,等. 奶牛隐性乳房炎致病菌的微生物学鉴定[J]. 中国乳业,2007,11:60-61.

[10] Riekerink R.G.M.O, Barkema H. W. Veenstra S.et al. Prevalence of contagious mastitis pathogen sinbulk tank milk in Prince Edward Island[J].Can.Vet.J.,2006,47:566-573.

Isolation and Identification of Pathogenic Bacteria of Mastitis in Milk

LIU Ge, FAN Zi-yi, ZHANG Pei-sheng, YANG Hui-min, QU Yong-gang
(College of animal science and technology, Shihezi University, Shihezi 832003)

Mastitis is a common disease of dairy cows which is generally divided into clinical mastitis and subclinical mastitis categories.Since the symptoms are mild subclinical mastitis and often been ignored, not only seriously affect the diseased cow,s milk production, milk quality, prolong postpartum estrus and pregnancy time, and easy to spread popular in the herd, causing serious losses to the dairy industry, at the same time the quality of the milk changes, but also endanger human health.Therefore, the active prevention and control of bovine subclinical mastitis is significance.In this study, Serratieae, Staphylococcus and Escherichia coli were punfied and iedentified from samples of subclinical mastitis cows milk and microbial diversity analysis of milk from subclinical mastitis cows was done. The result provide a theoretical basis for the cow mastitis and subclinical mastitis prevention.

Subclinical mastitis; Separation identification; Diversity; Prevention and Cure

S858.23

A

1004-4264（2017）02-0038-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.02.010

2016-06-20

国家自然基金，“新疆北疆地区奶牛乳房中微生物多样性及其功能分析”（编号：31560699)。

刘鸽（1986-），男，山东省淄博人，硕士研究生，主要从事动物传染病诊断与防治工作。

屈勇刚（1971-），男，陕西省渭南人，副教授，主要从事动物传染病诊断与防治工作，