高效液相色谱法检测猪蹄耳表皮中的脱氢松香酸

杜盼盼+耿志明+任双

摘要：建立了猪蹄（耳）表皮中脱氢松香酸的高效液相色谱分析方法。样品中的脱氢松香酸经乙腈提取离心后，采用高效液相色谱-荧光检测器进行检测。色谱柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：2 mmol/L磷酸溶液-甲醇（体积比14 ∶86）；流速：1 mL/min；激发波长225 nm，发射波长288 nm。结果表明：线性范围0.05～2 mg/L，检出限为0.05 μg/g，定量限为0.15 μg/g。在0.5～5 μg/g的添加范围内回收率为84.5%～98.9%。实际样品检测结果显示，部分生熟猪蹄（耳）制品检出脱氢松香酸，含量1.01～2.04 μg/g。本研究建立的分析方法方便、快捷，具有良好的靈敏度和准确性，可用于猪蹄（耳）表皮组织中脱氢松香酸的检测。

关键词：猪蹄；猪耳；高效液相色谱；脱氢松香酸；松香

中图分类号： TS251.7 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）11-0309-03

松香是以松树为原料加工得到的非挥发性天然树脂，广泛应用于化妆品、药品、食品包装材料以及造纸、建筑等领域[1-3]。松香酸和脱氢松香酸是松香的主要成分[4]。研究表明，松香酸、脱氢松香酸及其氧化产物是皮肤接触过敏原[5-6]，对鱼类的生长发育具有不利影响[7]，会降低方形网纹溞生殖能力[8]、导致人体上皮细胞和成纤维细胞生物活性显著下降[9]，以及人体红细胞和多核性白细胞坏死[10-11]。松香具有良好的黏附性，曾广泛用于畜禽屠宰加工的二次脱毛工序。2009年，我国明令禁止在畜禽屠宰中使用松香脱毛，但小企业、小作坊畜禽屠宰加工时违法使用松香脱毛的现象依然十分严重。在使用松香脱毛时，松香主要成分松香酸和脱氢松香酸，通过畜禽胴体表皮毛孔残留在表皮组织中，并且后续加工方式（腌制、蒸煮、烘烤等）难以将其有效去除[12]。消费者食用以松香脱毛加工畜禽肉为原料的食品，可能会对人体健康带来安全隐患。

有关松香酸和脱氢松香酸的分析方法主要有气相色谱法（GC）[13-14]、高效液相色谱法（HPLC）[15-16]、酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[17]等，分析的对象主要包括中药材[18]、包装材料、化妆品以及造纸企业废水等。畜禽肉制品中松香残留的安全隐患已引起人们的关注，张苏珍等分别建立了水禽表皮组织中松香酸和脱氢松香酸含量的高效液相-紫外（HPLC-UV）检测方法，并对白条鸭以及盐水鸭、烤鸭等制品中松香酸和脱氢松香酸的含量进行了分析，发现相当高比例的样本中同时含有松香酸和脱氢松香酸[19-20]。

猪头、猪蹄的加工曾广泛采用松香脱毛，小作坊违法使用松香加工猪头、猪蹄的现象仍时有报道[21]。本研究在前期建立的肉鸭表皮组织中脱氢松香酸残留HPLC-UV检测方法[20]的基础上，以猪蹄（耳）为对象，建立猪蹄（耳）表皮中脱氢松香酸的高效液相-荧光（HPLC-FLD）检测法，并对市场上销售的生熟猪蹄（耳）表皮中的脱氢松香酸含量进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪蹄（耳）购自南京天环食品有限公司，将8个未脱毛的猪蹄采用人工脱毛和松香脱毛，然后分别将其中2个人工脱毛和松香脱毛的猪蹄煮熟。人工脱毛和松香脱毛的猪蹄分别作为阴性样本和阳性样本。猪耳的处理同上。所有样本取表皮组织，剁碎，混合均匀，-20 ℃条件下保存。

调查样本猪蹄（耳）购于附近生猪肉商贩、卤肉店和大型超市。所有样本取表皮组织，剁碎，混合均匀，-20 ℃条件下保存。

脱氢松香酸标准品（纯度95%），加拿大TRC公司；乙腈（色谱纯），美国默克公司；甲醇（色谱纯），美国默克公司；超纯水由ULUPURE纯水仪制备，其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Waters高效液相色谱（配有e2475可变波长荧光检测器FLD及Empower色谱工作站），美国沃特世公司；高速冷冻离心机，德国Herolab公司；KQ-300DE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；电子天平，意大利BEL公司；XW-80A微型涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂；纯水仪，西安优普仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制 称取适量脱氢松香酸标准品，溶于乙腈，配制成100 mg/L的脱氢松香酸储备液。吸取适量标准储备溶液，用甲醇稀释配制成浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L的脱氢松香酸标准品的系列工作溶液。

1.3.2 样品处理 称取1 g混合均匀的样品于10 mL离心管中，加入5 mL乙腈，涡旋振摇混合1 min，超声波充分振荡15 min，离心机5000 r/min离心5 min。准确吸取4 mL上清液，氮吹仪吹干，用2 mL甲醇溶解后，经0.22 μm微孔滤膜过滤，待高效液相色谱分析。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：2 mmol/L磷酸溶液-甲醇（体积比14 ∶86）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；激发波长225 nm，发射波长 288 nm；进样量20 μL。

1.3.4 精密度试验 称取混合均匀的阳性样本6份，按照上述样本处理方法处理，进行高效液相色谱测定，测定的试验结果分析计算相对标准偏差（RSD）。

1.3.5 回收率试验 称取阳性猪蹄表皮样本1 g于10 mL离心管，分别添加0.5、1.0、5.0 μg脱氢松香酸标准品，在室温下放置30 min。按照上述样本处理方法进行脱氢松香酸的提取，最后用高效液相色谱进行测定，以测定的脱氢松香酸含量减去样本原有量和添加量的比值计算回收率。

2 结果与分析

2.1 样本处理

在松香酸和脱氢松香酸的HPLC-UV分析方法中，样本中的松香酸和脱氢松香酸通常采用有机溶剂（甲醇、乙腈等）提取，通过固相萃取（SPE）小柱净化除去基质中的干扰物质。脱氢松香酸除了具有紫外吸收外，还具有荧光特性。本试验利用脱氢松香酸具有的荧光特性，采用荧光检测器进行检测，并观察了SPE小柱对脱氢松香酸色谱图的净化效果。结果表明，样本中的脱氢松香酸经乙腈提取直接进行HPLC-FLD分析，干扰物质即可与脱氢松香酸获得基线分离，SPE小柱未明显改善脱氢松香酸的分离效果。提取液离心吹干后直接进样分析，节约成本并缩短了分析时间。

2.2 色谱条件优化

脱氢松香酸的最大紫外吸收峰在200 nm，但在实际利用紫外检测器进行分析时，在200 nm分析目标物会受到样品基质的干扰，尽管可以通过适当增加检测波长降低基质干扰，但也会对灵敏度带来不利影响。本研究根据脱氢松香酸的荧光特性，建立其HPLC-FLD检测方法，并通过激发波长和发射波长的扫描，确立脱氢松香酸的激发波长和发射波长分别为225 nm和288 nm。

本研究还观察了3种流动相体系0.1%甲酸溶液-甲醇（体积比2 ∶8）、2%冰醋酸溶液-甲醇（体积比1 ∶9）和不同比例的2 mmol/L磷酸溶液-甲醇，对脱氢松香酸在反相C18柱保留效果的影响。结果表明，2 mmol/L磷酸-甲醇（体积比14 ∶86）作为流动相时，脱氢松香酸峰形良好、保留时间适中。

本研究还观察了温度对脱氢松香酸在反相C18柱上的保留效果的影响，发现温度对脱氢松香酸的保留时间有一定影响，但对检测灵敏度影响不大。结果表明适宜条件为温度30℃，在设定的色谱条件下，脱氢松香酸保留时间约 10.1 min。图1和图2分别是本试验设定的色谱条件下标样和阳性样本中脱氢松香酸的色谱图。

2.3 方法的线性范围、检测限和定量限

本研究通过建立脱氢松香酸的标准曲线，以外标法分析样品中的脱氢松香酸含量。用流动相分别配制质量浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L的脱氢松香酸系列工作浓度，进行检测分析。标准曲线以脱氢松香酸质量浓度为横坐标x，以峰面积为纵坐标y，得到线性回归方程y=2 804 890x+58 110，相关系数r=0.999 8。由此可以看到在0.05～2.0 mg/L范围内，脱氢松香酸质量浓度与峰面积呈良好线性关系。按照3倍信噪比（RSN=3）和10倍信噪比（RSN=10）计算检测限和定量限，分别为0.05、0.15 μg/g 。

2.4 精密度和回收率试验

本方法的精密度通过阳性样本的日内和日间试验来评价。其中，生猪蹄阳性样本日内试验脱氢松香酸的平均含量为1.83 μg/g，精密度RSD为4.4%；日间试验脱氢松香酸的平均含量为1.80 μg/g，精密度RSD为5.5%。 熟猪蹄阳性样本日内试验脱氢松香酸的平均含量为1.62 μg/g，精密度RSD为3.1%；日间试验脱氢松香酸的平均含量为1.58 μg/g，精密度RSD为4.4%。生猪耳阳性样本日内试验脱氢松香酸的平均含量为1.93 μg/g，精密度RSD为3.1%；日间试验脱氢松香酸的平均含量为1.96 μg/g，精密度RSD为4.6%。熟猪耳阳性样本日内试验脱氢松香酸的平均含量为1.68 μg/g，精密度RSD为4.2%；日间试验脱氢松香酸的平均含量为 1.73 μg/g，精密度RSD为4.6%。试验结果表明，本研究建立的猪蹄（耳）表皮脱氢松香酸含量测定方法具有较好的精密度。

为验证本研究建立的猪蹄（耳）表皮中脱氢松香酸含量检测方法的准确度，本试验采用合适的阴性样本进行添加回收试验。在阳性添加回收试验中，生熟猪蹄脱氢松香酸的回收率范围为84.5%～92.8%。，生熟猪耳脱氢松香酸的回收率范围为86.7%～98.9%。试验结果表明，本研究建立的猪耳猪蹄表皮脱氢松香酸含量测定方法具有较好的准确度。

2.5 实际样本分析

本研究选取一般卤肉店、品牌卤肉店、超市等26个猪耳猪蹄样本，按照“1.3.2”节样本预处理后分析表皮组织中的残留脱氢松香酸含量，结果见表2。生猪肉商贩采集的样本包括8个生猪蹄，其中1个生猪蹄检出脱氢松香酸，含量1.33 μg/g，阳性率12.5%，一般卤肉店9个加工过的熟食猪蹄或猪耳（熟食制品），4个熟食制品检出脱氢松香酸，含量1.01～2.04 μg/g，阳性率为44.4%；品牌卤肉店和超市采集的9个样本均未检出脱氢松香酸。

从上述结果可以看出，农贸市场生猪肉商贩中的生猪蹄只有少量采用松香进行脱毛处理，但一般卤肉店家庭作坊生产制作的熟食制品的阳性率高达44.4%，表明这些作坊在加工熟食制品前仍然采用松香脱毛处理，这也与新闻媒体有关家庭作坊违法使用松香生产熟食制品的报道基本一致。品牌卤肉店和超市采集的样本中未检出脱氢松香酸，表明正规企业生产加工生熟猪蹄和猪耳等制品时不使用松香进行二次脱毛处理，产品质量值得信赖。与张苏珍等报道的鸭肉生熟制品[19-20]相比，本试验中阳性样本猪蹄、猪耳的脱氢松香酸含量相对较低。猪耳猪蹄的表皮毛孔比鸭鹅表皮致密得多，这可能是其脱氢松香酸含量相对较低的原因，但超过四成的家庭作坊生产制作的猪蹄（耳）等熟食制品检出松香残留，可能带来的食品安全隐患值得关注。

3 结论

本研究建立了猪蹄（耳）表皮组织中脱氢松香酸含量的HPLC-FLD检测方法，样品中的脱氢松香酸经乙腈和超声波振荡提取，以2 mmol/L磷酸溶液-甲醇（体积比14 ∶86）为流动相，在反相C18柱进行分离，用荧光检测器进行检测。线性范围0.05～2 mg/L，检测限和定量限分别为0.05 μg/g和0.15 μg/g。在0.5～5 μg/g的添加回收试验中，生熟猪蹄的平均回收率为89.2%；生熟猪耳的平均回收率为93.2%。对农贸市场中的生猪肉商贩、卤肉店和超市中的生熟猪蹄和猪耳进行了采样分析。结果表明，农贸市场采集的部分生熟猪蹄（耳）中檢出脱氢松香酸。本研究建立的猪蹄（耳）表皮中脱氢松香酸的高效液相色谱检测方法，可用于生熟猪蹄、猪耳制品中脱氢松香酸残留的测定，也可用于生熟猪蹄、猪耳制品生产过程中违法使用松香二次脱毛的监管，对于确保食品质量安全具有一定意义。

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