LKB1基因对前列腺癌细胞增殖的影响

刘 治，潘大庆，徐从云，陶 陶，吴 奎，肖 峻

目前，前列腺癌已经成为男性最常见的泌尿系恶性肿瘤之一，我国前列腺癌患者的人数也有逐年增加的趋势，防治前列腺癌的发生和提高前列腺癌患者生存率已迫在眉睫。因此，对于前列腺肿瘤细胞分子机制的探讨也是目前临床研究的重点方向。LKB1/STK11(liver kinase B1/serine-threonine kinase 11)基因编码433个氨基酸，其中包括N端结构域、C端结构域和激酶结构域。LKB1广泛表达于人多个器官以及组织中，如胰腺、肾、肺、结肠等，且参与调控多种生物学过程，如细胞能量代谢、细胞周期、细胞增殖及细胞极性。目前，大多数研究表明LKB1作为抑癌基因在多种恶性肿瘤中呈低表达，如非小细胞肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、肝癌等。在常染色体显性遗传黑斑息肉综合征(peutzJeghers syndrome, PJS)患者中也发现存在LKB1基因突变的现象，而且PJS综合征患者的癌症如消化道恶性肿瘤的概率也明显增加[1-4]。本实验以高表达LKB1蛋白的前列腺癌细胞系(PC-3)为研究对象，针对LKB1基因过表达后探讨PC-3的生物学行为改变，为进一步探讨列腺癌的发病机制提供思路。

1 材料与方法

1.1一般资料PC-3、pLV-EGFP(2A)Puro载体由上海拜科生物公司提供；Flag抗体、β-actin均购于Abcam 公司；细胞总RNA提取试剂盒(RNAprep pure Cell Kit)、反转录试剂盒购自天根生物公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自于Thermo Scientific公司，ECL发光试剂盒由上海天能科技公司提供，PVDF膜购自美国Millipore公司。

1.2方法

1.2.1质粒构建 根据人LKB1全长基因序列设计出一对PCR引物，上游引物包含EcoR I酶切位点，下游引物含Xho Ⅰ酶切位点并且携带Flag标签。上游引物序列：5′-CCGGAATTCATGGAGGTGGTGGACCCGCA-3′，下游引物序列5′-CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTGCTGC TTGCAGGCCGACAGC-3′，引物均由上海生物公司合成。根据以上设计合成的引物应用KOD酶扩增LKB1序列，反应条件为：98 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min延伸。反应所得PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化PCR产物，-20 ℃保存。

用EcoR I和Xho I限制性内切酶对载体pLV-EGFP(2A)Puro以及PCR胶回收产物进行双酶切，然后将酶切回收得到的目的基因片段和载体进行连接反应，反应后的反应体系转化DH5α感受态菌株，并涂板于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上，于次日挑克隆进行菌落PCR验证，并将阳性克隆送检进行测序比对(测序在上海生物工程公司完成)。

1.2.2重组慢病毒的包装 待细胞密度达70%～80%时，将重组慢病毒载体质粒pLV-EGFP(2A)Puro-LKB1-Flag和包装质粒，按照Lipofectamine 2000使用说明书共转染包装细胞293T细胞。转染后20 h更换为完全培养基，24 h之后，镜下可观测到细胞融合现象(提示病毒包装成功并开始产生病毒颗粒)。转染48、72 h后分别收集细胞上清液，1 500 r/min×10 min离心，0.45 μm滤过膜过滤，分装至离心管，12 000 r/min×30 min、4 ℃离心浓缩病毒，于-80 ℃保存备用。存放于液氮中更佳。

1.2.3重组慢病毒感染以及稳定株筛选 将PC-3细胞稀释成1×105/mL细胞悬液，再以1×104/孔的密度接种于6孔板，然后加入重组慢病毒滤液，感染24 h后弃去含病毒的培养基，更换新鲜的完全培养基。继续培养24 h后，加入终浓度2 μg /mL嘌呤霉素，每隔2天左右更换1次含嘌呤霉素(终浓度2 μg/mL)的培养基。2周后收集细胞，采用qPCR/Western blot法检测LKB1的蛋白表达水平。

1.2.4Western blot法检测LKB1蛋白的表达水平 弃去空白对照组(Blank组)、阴性对照组(NC组)以及LKB1过表达组(LKB1组)PC-3细胞中的培养液，预冷PBS清洗细胞1遍，收取各组细胞，使用RIPA细胞裂解液裂解3组PC-3细胞，然后提取细胞总蛋白；按BCA蛋白浓度测定法检测3组PC-3细胞总蛋白浓度；平衡各组上样浓度，然后使用SDS-PAGE凝胶电泳，随后5%牛奶封闭1 h，分别用Flag、β-actin一抗4 ℃孵育过夜(Flag、β-actin抗体稀释比分别为1 ∶1 000，1 ∶200，HRP标记的二抗(1 ∶1 000)室温孵育1 h，最后ECL发光显色。

1.2.5qPCR检测LKB1 mRNA的表达 提取Blank组、NC组、LKB1组PC-3细胞的总RNA，随后分别以3组PC-3细胞总RNA为模板反转录合成cDNA，然后分别用LKB1，内参的引物进行PCR扩增，qPCR法检测细胞中LKB1 mRNA的表达，LKB1引物序列：正向5′-TGGTTCCGGAAGAAACATCCC-3′，反向5′-CACCGTGAAGTCCTGAGTGTAG-3′；GAPDH引物序列：正向5′-TCAACGACCCCTTCATTGAC-3′，反向5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。

1.2.6CCK-8法检测PC-3细胞的增殖能力 取密度长到约90%的未处理的Blank组PC-3细胞，以及NC组和LKB1组的PC-3稳转细胞系接种于96孔板，实验孔每孔为3×103/mL细胞，96孔板边缘预留空白孔并加入等量灭菌PBS溶液，同时3组分别设置3个复孔。分别在铺细胞后0、24、48、72 h时每孔中加入一定量的CCK-8溶液，继续培养2 h，利用酶标仪测定各实验孔吸收光值，并根据所得数据绘制各组细胞的生长曲线图。

1.3统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，计数资料采用t检验、计量资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1Westernblot法检测LKB1蛋白的表达利用Western blot法检测Blank组、NC组、LKB1组PC-3细胞中LKB1蛋白的表达，结果显示LKB1组PC-3细胞过表达LKB1(图1)。

2.2qPCR法检测LKB1的表达利用qPCR法检测Blank组、NC组、LKB1组PC-3细胞中LKB1 mRNA的表达，相对于Blank组、NC组，LKB1组PC-3细胞中LKB1 mRNA的表达显著升高(图2)。

图1 PC-3细胞中LKB1蛋白的表达

图2 PC-3细胞中LKB1 mRNA的表达

2.3CCK-8法检测PC-3细胞的增殖能力CCK-8法检测Blank组、NC组、LKB1组PC-3细胞0、24、48、72 h各时间点细胞的活力，结果显示LKB1组PC-3细胞的生长活力于铺细胞24 h后开始，明显低于Blank组及NC组PC-3细胞；但Blank组以及NC组PC-3细胞生长活力差异无显著性(表1)。3组细胞的生长曲线图显示，LKB1组PC-3细胞与Blank组PC-3细胞相比，生长速度受到明显抑制，而Blank组和NC组PC-3细胞相比生长速度差异无显著性(图3)。

图3 LKB1对PC-3细胞增殖的影响

分组0h24h48h72hBlank组0.1321±0.0250.2407±0.0290.4351±0.0340.7775±0.047NC组0.1297±0.0160.2398±0.0310.4317±0.0240.7801±0.029LKB1组0.0835±0.0290.1568±0.0280.2340±0.0410.3750±0.026

3 讨论

前列腺癌是多因素、多步骤、多基因共同作用的结果，涉及肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭、迁移等一系列生物学过程。目前，大多数研究认为LKB1可以通过激活AMPK和抑制mTOR进而调节肿瘤细胞的增殖，在能量不足的情况下，AMPK通路上游基因LKB1能够磷酸化AMPK，从而激活AMPK，负性调控下游mTOR活性，并进一步影响肿瘤的进展。大量研究表明，LKB1在多种肿瘤，如子宫颈肿瘤卵巢癌、肾透明细胞癌中低表达甚至缺失，而且这些肿瘤的发生、发展也与LKB1基因密切相关[5-8]。研究发现，在肺腺癌、鳞癌以及大细胞癌等不同亚型的肺癌中，发现均存在LKB1基因的突变[9-11]。相关研究表明，在LKB1基因敲除后的肿瘤细胞中，相比于正常未经处理的肿瘤细胞，AMPK的表达降低，而且LKB1基因敲除后的肿瘤细胞的增殖活性及侵袭能力会明显增强。这些实验结果均提示我们LKB1是重要的抑癌基因，抑制LKB1会增强肿瘤细胞的增殖、分化及侵袭。

现有研究中，病毒已经成为常见的DNA或RNA有效载体。利用病毒为载体可以大大提高DNA或RNA进入细胞的效率，因此在基因传递载体中最为高效[12]。慢病毒载体具有以下特征：(1)能够将目的基因整合至宿主基因组中，稳定表达；(2)具有感染分裂和非分裂细胞的能力；(3)具有广泛性[13]。本实验成功构建了LKB1过表达慢病毒质粒，分别转染LKB1过表达质粒及阴性对照空载质粒于前列腺癌PC-3细胞，再经过嘌呤霉素筛选得到NC组稳转细胞系、LKB1过表达组稳转细胞系。并且利用CCK-8法检测了LKB1对不同组细胞增殖状态的影响。qPCR和Western blot检测结果表明，与Blank组、NC组比较，LKB1组的LKB1 mRNA水平和蛋白表达水平均明显升高；CCK-8实验结果表明，与Blank组和NC组相比，LKB1组PC-3细胞的增殖能力明显受到抑制，表明LKB1基因表达增强后，会明显抑制PC-3细胞的增殖能力。提示我们LKB1基因在前列腺癌发生、发展中发挥重要作用，LKB1可作为研究前列腺癌细胞增殖分子机制的新靶点。

细胞持续旺盛的增殖是肿瘤细胞重要的特征之一，如何调控肿瘤细胞的增殖是目前肿瘤治疗的重点研究内容之一。由于现在对LKB1在肿瘤发生、发展进程中所发挥的功能尚未完全清楚，LKB1所涉及的信号通路和其在相关信号通路中所参与的机制也没有完全清楚。本实验初步探讨了过表达LKB1后对前列腺癌细胞增殖能力的影响，为进一步观察LKB1的分子机制和深入探讨LKB1在肿瘤发生、发展中的作用提供了一定的理论基础，也为后续研究前列腺癌细胞的增殖调控机制提供潜在的重要靶点。

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