早期食管癌中ATM和p16蛋白的表达及临床意义

韩 笑，陆荣柱

食管癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，我国食管癌的发病率居全球之首，每年发病率和病死率均占全球发病率和病死率的一半以上。食管癌的5年生存率仅为10%，但早期食管癌的生存率可达90%[1]。所以“早发现、早诊断、早治疗”对于食管癌患者来说意义重大。ATM和p16基因均为抑癌基因，两者通过特定途径影响细胞周期，在食管癌的发生中起重要作用。本文采用免疫组化法检测ATM和p16蛋白在早期食管癌组织及癌旁正常鳞状上皮组织中的表达，探讨两者在早期食管癌发生中的作用及两者的相关性，旨在为诊断早期食管癌提供新方法。

1 材料与方法

1.1一般资料选取淮安市肿瘤医院2012年1月～2015年12月手术后经病理证实的早期食管癌患者69例，其中男性42例，女性27例，年龄46～78岁，平均62岁。所选取组织肉眼分型有糜烂型、斑块型、隐伏型，以斑块型为主；病理组织学类型均为鳞状细胞癌，其中原位癌9例，黏膜内癌22例，黏膜下癌38例，高分化23例，中分化30例，低分化16例；癌旁组织均为早期食管癌患者手术后大标本的切缘组织，组织学上均为正常的鳞状上皮组织。

1.2方法采用免疫组化SP法检测ATM蛋白和p16蛋白的表达。免疫组化染色严格按试剂盒说明进行，用PBS缓冲液作为一抗，作为阴性对照；用已知的阳性片作为阳性对照。ATM抗体购自Abcam公司，p16抗体、SP试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新公司。

1.3结果判定ATM蛋白和p16蛋白部分表达于细胞核，部分表达于细胞质，镜下细胞核或细胞质内呈现棕黄色颗粒。(1)按着色程度评分：无阳性染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。(2)按阳性细胞百分比评分：阳性细胞数<10%为0分，10%～25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分。将两项得分结果相乘：0分为阴性(-)；1分以上为阳性(+～)，其中1、2分为(+)，3、4分为()，6～9分为()。

1.4统计学方法采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析。ATM蛋白和p16蛋白表达与早期食管癌的临床病理特征的研究采用χ2检验，显著性检验水准α=0.05，P<0.05为差异有计学意义。ATM蛋白和p16蛋白表达的相关性分析采用Spearman相关分析，r<1.0为两者有相关性。

2 结果

本组实验中ATM蛋白和p16蛋白部分表达于细胞核，部分表达于细胞质。69例早期食管癌组织中ATM蛋白阳性率为60.9%，p16蛋白阳性率为68.1%，两者在早期食管癌组织中的表达均低于癌旁正常鳞状上皮组织(图1、2)，两者表达与患者年龄、性别、肿块位置无关(P>0.05)，与分化程度、浸润深度有关(P<0.05)，随着分化程度的降低、浸润深度的加深，两者表达均下降(表1)。实验亦发现ATM蛋白和p16蛋白的表达有一定的相关性(r=0.598，表2)。

3 讨论

ATM基因是肌醇激酶-3(Phosphatidylinostiol 3-kinase, PI3K)基因家族的成员，是一种肿瘤抑制基因[2]。由其编码的ATM蛋白是一种自动磷酸化蛋白[3]，主要存在于细胞核和细胞质中。该蛋白最主要的功能区位于蛋白C末端，主要参与细胞周期的调控、DNA损伤识别和修复[4]。DNA损伤诱导ATM激活，ATM通过磷酸和去磷酸化一系列蛋白底物如p53等参与细胞周期检测点的监管和DNA损伤后修复信号网络系统，使受损的DNA阻滞细胞周期的G1/S期、S期和G2/M期这3个检测点，并对其进行修复。但当ATM由于突变而造成功能受损时，细胞则丧失这一功能，不能对受损的DNA给予正常修复，这样受损的DNA很容易随细胞分裂而传入子代细胞，最终导致细胞癌变。Seshagiri等[5]报道ATM蛋白和结肠癌也有一定的关系，Roberts等[6]报道ATM蛋白和胰腺癌有一定的关系，可见ATM蛋白在消化道肿瘤中起很大作用。本实验采用免疫组化法检测发现ATM在早期食管癌组织中的表达低于癌旁正常鳞状上皮组织，且其表达与组织分化程度、浸润深度有关。实验亦发现随着分化程度的降低、浸润深度的加深，ATM蛋白在早期食管癌组织中的表达越低。这说明当ATM由于突变而造成功能受损时，不能对受损的DNA给予正常修复，使得受损的DNA很容易随细胞分裂而传入子代细胞，最终导致细胞癌变。表明ATM蛋白低表达在早期食管癌的发生、发展中起重要作用。

表2 早期食管癌组织中ATM蛋白和p16蛋白表达的相关性

①②

图1 ATM在早期食管癌中的表达，SP法图2 p16蛋白在早期食管癌中表达，SP法

p16是一种非常重要的抑癌基因[7]，编码表达一个含148个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白可以特异性地与细胞周期素4(CDK4)结合，抑制CDK4的活性，从而使细胞生长停滞在G1期，细胞的生长受到抑制[8]。在肿瘤细胞内，p16基因突变或甲基化后失去正常的蛋白表达功能，出现细胞周期素D与CDK4结合增加，使细胞增殖加速，最终演变为细胞的生长活动失去控制。本组免疫组化检测结果发现，p16蛋白在早期食管癌组织中低表达，且其与组织分化程度、浸润深度有关，且随着分化程度的降低、浸润深度的加深，在早期食管癌组织中的表达越低。这些均说明p16蛋白的低表达或表达缺失在早期食管癌的发生、发展中起重要的促进作用。Noushin等[9]研究发现在食管癌中p16蛋白表达也下降，还有研究发现p16蛋白表达缺失可能出现在食管鳞状细胞癌发生的早期阶段[10]。

ATM和p16均为抑癌基因，可以使细胞周期停滞于G1期，使受损的DNA得到修复或者细胞生长得以抑制。在食管鳞状细胞癌中p16蛋白和多种蛋白相关性研究报道很多，赵醒等[11]报道p16蛋白和Cyclin D1的表达无明显相关性，本组实验结果显示，在早期食管癌中p16蛋白和ATM蛋白表达呈正相关(r=0.598)，两者表达是否有高度相关或者显著性相关，可能还要进一步扩大样本研究。实验亦发现38例ATM蛋白和p16蛋白同时阳性者中有24例患者分化程度均为Ⅰ～Ⅱ级、浸润深度在黏膜层以上，这表明联合检测两者的表达，对判断早期食管癌的分化程度和浸润深度上有一定提示作用，这也间接表明两者对预后有一定提示作用。

本组69例早期食管癌患者手术后均未行放、化疗，有2例死于脑血管疾病，1例术后随访胸部X线发现肺部小粟粒状阴影，拒绝进一步检查治疗，所以不能确定是否是转移灶。本组实验对ATM蛋白和p16蛋白在早期食管癌中的表达情况进行观察，旨在为诊断早期食管癌提供新的诊断思路和方向，且两者表达呈正相关，对判断早期食管癌的分化程度和浸润深度上有一定的提示作用。

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