胸腺瘤中E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表达

黄 波，徐咏强，梁远秋

胸腺瘤(thymoma)是一种呈惰性生长并且具有潜在恶性的胸腺上皮源性肿瘤，既有非常复杂的镜下结构，又存在病理与预后之间的矛盾，其发生机制目前仍不清楚。

上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)机制和Wnt信号传导通路是目前肿瘤研究的焦点。大量研究显示在乳腺癌和结肠癌等多种肿瘤的侵袭过程中均伴有肿瘤细胞的EMT现象和Wnt信号传导通路的改变。胸腺瘤是一种生物学行为非常复杂的肿瘤，目前研究认为30%～40%的胸腺瘤具有侵袭性。β-catenin基因定位于3q21.3，是Wnt信号通路中的重要调节因子，若其在细胞中出现异常积聚，则可导致肿瘤具有侵袭性[1-2]。E-cadherin是介导细胞间黏附的重要细胞因子，其低表达或者不表达被认为是EMT过程的标志，亦可促进肿瘤细胞的侵袭。E-cadherin与β-catenin结合形成E-cadherin-catenins复合体，其结构和功能的异常与许多肿瘤的侵袭密切相关。本组实验联合免疫组化和荧光原位杂交检测，旨在探讨E-cadherin和β-catenin蛋白及基因的表达与胸腺瘤侵袭性的相关性。

1 材料与方法

1.1材料选取2012年～2016年东莞市人民医院存档的胸腺瘤手术标本，即往诊断为A型、AB型、B1型、B2型、B3型及C型胸腺瘤的病例共120例。

1.2方法根据WHO(2015)胸腺肿瘤分类标准及Masaoka临床分期方法、组织形态学特征、免疫组化标记、临床特点和影像资料，对120例胸腺瘤按无侵袭性和有侵袭性分组，并对各组分别行E-cadherin和β-catenin蛋白免疫组化染色(SP法)及E-cadherin和β-catenin基因荧光原位杂交实验。E-cadherin和β-catenin抗体免疫组化检测设立PBS液代替一抗作阴性对照，以试剂盒内已知的阳性对照片作阳性对照。

1.3结果判定

1.3.1免疫组化染色结果半定量分析 E-cadherin蛋白主要定位于细胞膜，即细胞膜中出现棕黄色颗粒视为E-cadherin蛋白阳性。β-catenin蛋白则以细胞内出现棕黄色颗粒作为阳性标志，一般从胞膜、胞质和胞核三方面综合判断β-catenin蛋白在胞内的分布情况：胞膜>70%的细胞出现阳性则视为正常表达，反之<70%则视为膜表达缺失；胞质、胞核>10%的细胞阳性视为胞质、胞核阳性表达，胞质、胞核阳性表达常称作异位表达，胞膜表达缺失及胞质、胞核表达均为异常表达。一般胞膜正常表达判为阴性，异常表达判为阳性。两者均以阳性细胞百分比结合染色强度进行综合计分。(1)染色强度评分标准：无着色为0分；淡黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。(2)阳性细胞数评分标准：阳性细胞数≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分，>75%为4分。将两项得分结果相乘：0分为阴性(-)，1～4为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(2+)，9～12分为强阳性(3+)。

1.3.2FISH实验结果判读 E-cadherin基因结果判定：(1)阈值设定：随机选取10例以上阴性对照样本作为阴性质控片，每张阴性质控片随机计数至少100个细胞，分别计算出各类型FISH阳性细胞的细胞数目及百分比，同时统计出百分比的标准差和平均值，阴性阈值则设为平均值+3倍的标准差。(2)计数方法：计数至少100个细胞，出现2R2G信号类型的细胞记为FISH阴性细胞；出现nR2G(n≤1)信号类型的细胞记为FISH阳性细胞。①若出现FISH阳性细胞的比例大于阴性阈值时，判断为FISH阳性；②若出现FISH阳性细胞的比例小于阴性阈值时，判断为FISH阴性；③如果FISH阳性的细胞比例与阴性阈值相等，则需加大计数的数目或者分析整张切片，如果仍然比阴性阈值小，则判为FISH阴性；否则视为FISH阳性。

β-catenin基因结果判定：β-catenin基因的探针采用绿色标记，正常细胞胞核中绿色的点为2个，当绿色点>2个时，说明该基因有扩增。高倍镜下计数100个细胞核，其中标记基因信号数≥3的细胞核数目>40个，记为该病例扩增；11～40个之间记为临界扩增；0～10个之间则记为无扩增。

1.4统计学处理采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。对组织中E-cadherin和β-catenin蛋白和基因的表达水平在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中行χ2检验，检验水准以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1镜检无侵袭性胸腺瘤大多为A、AB和B1型(图1)。A型胸腺瘤几乎无淋巴细胞，瘤细胞表现为卵圆形或梭形，且细胞核仁不明显，肿瘤细胞呈实性片块状或车辐状排列。AB型胸腺瘤组织学上呈弥散分布的结节状，通常由淋巴细胞少的A型以及富含淋巴细胞的B型胸腺瘤混合而成。在A型成分区可见到所有A型胸腺瘤的特征，而B型成分区则是独特的。B型成分区瘤细胞通常由小多角形上皮细胞组成，核小而圆。B1型胸腺瘤上皮细胞小且少，异型性通常不明显，周围可见非肿瘤性的T淋巴细胞环绕，可见胸腺小体。侵袭性胸腺瘤大多为B2、B3及C型(图2)。B2胸腺瘤呈纤细分隔的粗大小叶，部分类似于正常胸腺皮质小叶结构，呈多角形，胞核大，染色质较稀疏，可见明显的中位核仁。B3及C型胸腺瘤在组织学上肿瘤细胞呈小叶状，通常由较厚的纤维及透明样变的间隔分隔开，上皮内的淋巴细胞稀少，瘤细胞形成表皮样结构或者呈模糊的实性片状。

2.2E-cadherin和β-catenin蛋白在胸腺瘤中的表达E-cadherin蛋白在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中的阳性率分别为87.69%(57/65)和58.18%(32/55)，差异有统计学意义(P<0.05)。β-catenin蛋白在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中的阳性率分别为12.31%(8/65)和43.64%(24/55)，差异有统计学意义(P<0.05)(表1，图3～6)。

表1 E-cadherin、β-catenin蛋白在有侵袭性和无侵袭性胸腺瘤中的表达

2.3E-cadherin及β-catenin基因表达E-cadherin基因在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中表达下调或缺失分别为15.38%(10/65)和56.36%(31/55)，统计分析显示，E-cadherin基因在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)。β-catenin基因在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中的表达扩增率分别为26.15%(17/65)和58.18%(32/55)，统计分析显示，β-catenin基因在无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤中的表达，差异有统计学意义(P<0.05)(表2，图7、8)。

表2 E-cadherin、β-catenin基因在有侵袭性和无侵袭性胸腺瘤中的表达

3 讨论

本组120例胸腺瘤，按照WHO(2015)胸腺肿瘤新分类标准，综合胸腺瘤镜下特点、免疫标记、Masaoka临床分期标准、临床表现、影像资料以及相关文献将其分类，其中侵袭性胸腺瘤55例，无侵袭性胸腺瘤65例。胸腺瘤患者的预后水平与肿瘤是否发生侵袭关系密切，大量研究表明，有侵袭性的胸腺瘤患者预后水平明显比无侵袭性的胸腺瘤患者差，无侵袭性的胸腺瘤患者5年和10年生存率分别为75%和63%，而有侵袭性胸腺瘤患者的5年和10年生存率分别为50%和30%[3-5]。本实验联合免疫组化及荧光原位杂交技术分别检测E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表达，以期为有侵袭性和无侵袭性胸腺瘤的诊断和鉴别诊断提供有效的生物学指标。本组实验结果表明，E-cadherin、β-catenin蛋白和基因的表达与胸腺瘤的侵袭性有显著相关性。

①②③④⑤⑥⑦⑧

图1无侵袭性胸腺瘤(AB型)：肿物由淋巴细胞较少的A型成分及富于淋巴细胞的B型成分构成，A型成分细胞呈梭形，B型成分细胞呈小多角形，核较小，圆形或卵圆形，核仁不明显图2有侵袭性胸腺瘤(B3型)：由呈巢片状生长的上皮样细胞和淋巴样细胞混合增生构成，上皮样细胞核呈空泡状，核仁明显图3无侵袭性胸腺瘤中E-cadherin蛋白阳性，SP法图4有侵袭性胸腺瘤中E-cadherin蛋白阳性，SP法图5无侵袭性胸腺瘤中β-catenin蛋白阳性，SP法图6有侵袭性胸腺瘤中β-catenin蛋白阳性，SP法图7有侵袭性胸腺瘤组织中E-cadherin基因阳性，FISH图8有侵袭性胸腺瘤组织β-catenin基因扩增，FISH

近年随着分子遗传学研究在胸腺瘤分类和鉴别诊断方面的不断应用，使得分子生物学在胸腺瘤的诊断及鉴别诊断方面的地位日益突显[6]。相关研究证实，E-cadherin基因低表达或不表达及β-catenin基因高拷贝数扩增表达可促进多种肿瘤的侵袭。E-cadherin和β-catenin两种蛋白在胸腺瘤中的表达已有相关报道，然而这两种基因在胸腺瘤中的表达情况则尚未见相关报道。

E-cadherin作为一种钙依赖性细胞跨膜糖蛋白，近年来随着研究的不断深入，E-cadherin已成为探讨瘤细胞侵袭性的热点。E-cadherin是一种抑癌基因，位于人类16号染色体长臂16q22.1，其编码的氨基酸有723～748个[7]。E-cadherin几乎在所有上皮组织中呈不同程度的表达，在细胞之间的连接中起关键性作用，其能够影响肿瘤细胞与正常细胞之间的黏附，因此其表达水平下降将导致肿瘤的侵袭，从而影响患者预后[8-9]。如今，E-cadherin抑制癌细胞侵袭这一观点已经得到广泛认可[10-11]。E-cadherin表达异常可通过多种机制来促使肿瘤发生侵袭[12-13]：(1)E-cadherin表达异常将降低瘤细胞之间的黏附能力，使得肿瘤细胞脱离瘤体而发生侵袭；(2)E-cadherin表达异常可以促进人体基质金属蛋白酶的分泌和基质降解，加快细胞的侵袭；(3)脱离瘤体的细胞无接触抑制作用，将不再与相邻细胞竞争生长因子，因此得到的生长刺激信号将会更多；(4)瘤细胞与瘤体分离后发生侵袭能够得到更多营养。

胸腺瘤的发生、发展是多因素参与的复杂过程。近年来，随着分子遗传学及分子生物学等学科的飞速发展以及检测方法的日新月异，发现很多与胸腺瘤发病相关的基因，这对于我们更进一步认识胸腺瘤的发病机制、界定胸腺瘤的组织分型和分级、对患者进行生物治疗以及判断患者预后提供新方向。本组实验发现，E-cadherin基因在肿瘤细胞中的表达强度比在正常细胞中低，并且E-cadherin基因的表达强度与肿瘤的侵袭性密切相关。实验过程中采用荧光原位杂交技术检测E-cadherin基因时采取了红绿双探针，以此来做内对照，即红色探针是本组的目的基因，绿色探针是对照基因，且绿色对照基因位于红色目的基因的隔壁。当绿色信号正常而红色信号减少时，认为基因表达下调或缺失，当然要排除假阴性；而当绿色信号不足2个时，则该细胞不纳入计数范围。这些发现提示：E-cadherin参与的EMT机制在胸腺瘤的侵袭过程中有着非常重要的作用。综合分析，作者认为E-cadherin参与胸腺瘤的侵袭进程，其在有侵袭性和无侵袭性胸腺瘤的鉴别诊断中有一定的辅助意义。

β-catenin是由原癌基因编码的一种细胞骨架蛋白，位于染色体3q21.3，全长23.2 KB，含16个外显子，其相对分子质量为9.3×104。β-catenin是一种多功能蛋白质，参与细胞间的黏附和WNT信号的传导。β-catenin可以与E-cadherin的胞内区相互作用并参与E-cadherin黏附功能的调节，因此β-catenin发生故障会使E-cadherin参与细胞黏附失去稳定性。此外，其还可以与E-cadherin胞内区组成E-cadherin/cat复合体，这也是其发挥生物学效应的前提条件。Wnt信号通路包括包膜卷曲蛋白、Wnt蛋白、E-cadherin、β-catenin、GSK-3p、Axin、APC、TCf以及松散蛋白等，β-catenin在此通路中有着重要的地位，其不但参与信号的转导，还参与细胞间的黏附。此外，β-catenin还可激活EMT过程中的某些相关基因，如Fibronectin和Slug等，加速瘤细胞的EMT进程。多项研究结果显示，在结肠癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤的侵袭过程中均可见到β-catenin在细胞质和细胞核中的异常蓄积[14-15]。

本实验采用免疫组化法检测β-catenin蛋白和荧光原位杂交技术检测β-catenin基因表达，发现β-catenin蛋白和基因在有侵袭性和无侵袭性胸腺瘤中表达差异有统计学意义。结合本实验结果，作者认为β-catenin对有侵袭性和无侵袭性胸腺瘤的鉴别诊断有一定的辅助意义。

综上所述，本组实验结果显示，免疫组化法检测E-cadherin和β-catenin蛋白及荧光原位杂交技术检测E-cadherin和β-catenin基因，有助于无侵袭性和有侵袭性胸腺瘤的鉴别诊断。

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