草石蚕外植体消毒方法及不定芽增殖培养基研究

孟祥玉+张素勤+耿广东+熊娅

摘要：以草石蚕茎尖和叶片为外植体，研究了草石蚕（Stachys sieboldii Miq.）无菌系建立的方法和不定芽增殖适宜的培养基配方，为草石蚕组织培养快速繁殖和脱病苗培育奠定基础。结果表明，NaClO溶液比HgCl2溶液消毒效果好；茎尖和叶片在NaClO溶液中适宜的消毒时间分别为10～15 min和15 min，其污染率均为0，并且外植体未发生褐化现象。不定芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 1.5 mg/L，每个外植体可诱导6.6个不定芽，并且生长健壮。

关键词：草石蚕（Stachys sieboldii Miq）；外植体；消毒；不定芽增殖

中图分类号：Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6601-03

草石蚕（Stachys siebordii Miq.）又名甘露子、宝塔菜、地牯牛、地蚕等，为唇形科水苏属多年生宿根草本植物[1]，是中国的特色蔬菜之一[2-4]。草石蚕原产于中国北方，现重庆、山东、江苏、河北、内蒙古、陕西、广东等地均有种植。草石蚕具有十分丰富的营养价值，每1 kg草石蚕中含蛋白质55 g、脂肪3 g和碳水化合物203 g[5]。宋建清等[6]报道草石蚕中糖类含量高达12.47%，磷元素含量高达11.07 mg/g，是一种天然的磷源。草石蚕具有重要的药用价值，《本草纲目》称其“功能近似冬虫草”、既可为菜为药，又可充果，《陆川草本》载有：“滋养强壮，清补肺金，功类冬虫草，治身体赢瘦，虚劳咳嗽，小儿疳积”，《贵州草药》记载：“清肺解表，全草治风热感冒”。草石蚕中含有丰富的水苏糖，具有润肺益肾、滋阴补血的功能，可治疗气喘、肾虚腰痛、淋巴结核、肺结核咯血等病症[5]。

草石蚕为无性繁殖，常常携带大量病毒，并已成为草石蚕产量和品质下降的主要原因，因此草石蚕组织培养脱毒苗势在必行。无菌系的建立是组织培养的首要环节，但草石蚕植株（叶、茎）表面长有许多绒毛，容易携带大量污染微生物而不易消毒，常出现消毒时间短而导致污染；消毒时间长而导致外植体受到消毒剂毒害而发生褐化、死亡现象。目前关于草石蚕外植体消毒方法和芽增殖培养基方面的研究鲜见报道。因此，本试验针对草石蚕组织培养中存在的这些关键问题，研究了草石蚕外植体的消毒方法和芽增殖培养基适宜配方，为组织培养快速繁殖和脱毒苗生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为贵州省务川仡佬族苗族自治县主栽草石蚕品种。

1.2 试验方法

1.2.1 草石蚕外植体消毒方法的探索 用添加洗洁精的自来水浸泡草石蚕叶片和茎尖1～2 h，将其用清水冲洗干净。接着在75%乙醇中消毒2 s，用无菌水冲洗3次后，转入0.1% HgCl2或1% NaClO（有效Cl浓度）溶液中分别杀菌处理5、10、15和20 min，用无菌水漂洗5～6次，将已灭菌的叶片（切成 1 cm×1 cm方块）和茎尖接种到盛有MS培养基（添加琼脂粉7 g/L和蔗糖30 g/L，pH为6.0）的三角瓶中，每个处理接种6个三角瓶，每瓶接种2个外植体，3次重复。接种后将材料温度25 ℃、光照时间14 h（光照强度6 600 lx）培养，培养40 d后统计外植体污染和褐化情况。

1.2.2 草石蚕丛生芽增殖培养基的筛选 将消毒的茎尖接种到增殖培养基上培养。增殖培养基采用1.0、3.0、5.0 mg/L 6-BA（A），0.3、0.5、0.7 mg/L NAA（B），0.5、1.5、2.5 mg/L GA3（C） 3因素3水平L9（34）的正交试验设计，研究培养基中6-BA、NAA和GA3对不定芽增殖的影响。培养40 d后观察统计芽增殖生长情况。增殖系数的计算公式为：增殖系数=增殖芽数目/接种芽数目。

1.3 数据处理分析

采用DPS（7.05）软件对数据进行处理分析，LSD方法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同消毒剂对草石蚕外植体的消毒效果

由表1和表2可知，以草石蚕茎尖为外植体时，当0.1% HgCl2溶液消毒5 min时，污染率达100.0%，污染程度较重，并且茎尖出现了轻度褐化。当0.1% HgCl2溶液消毒10 min时，茎尖污染率和消毒5 min处理之间差异不显著，但是褐化率加重，差异极显著。当0.1% HgCl2溶液消毒15 min时，污染率进一步下降，但茎尖全部褐化。采用1% NaClO溶液消毒茎尖5 min时，污染率为20.0%，没有褐化现象。当消毒时间为10和15 min时，茎尖无污染发生，也没有出现褐化现象。当消毒时间为20 min时，虽然无污染发生，但15.0%茎尖出现了褐化现象。因此，以草石蚕茎尖为外植体时，1% NaClO溶液比0.1% HgCl2溶液消毒效果好，1% NaClO溶液适宜的消毒时间为10～15 min。

以草石蚕叶片为外植体时，不同的0.1% HgCl2溶液消毒时间均没有完全消除叶片污染现象，并且随着消毒时间的延长，褐化变得越来越严重。采用1% NaClO溶液消毒5和10 min時，无褐化现象，但污染率分别为14.3%和5.7%。1% NaClO溶液消毒15 min时既无污染发生，又无褐化现象。1% NaClO溶液消毒20 min时无污染发生，但有褐化现象，褐化率为37.1%。由此可知，以草石蚕叶片为外植体时，采用1% NaClO溶液比0.1% HgCl2溶液的消毒效果好，NaClO溶液最佳的消毒时间为15 min。

综上所述，无论对于茎尖或叶片哪种外植体，1% NaClO溶液比0.1% HgCl2溶液的消毒效果好。以茎尖为外植体时，NaClO溶液适宜的消毒时间为10～15 min；以叶片为外植体时，NaClO溶液适宜的消毒时间为15 min。

2.2 草石蚕不定芽增殖培养基的筛选

不同浓度的6-BA、NAA和GA3组合对草石蚕不定芽增殖的效果不同（表3）。处理7（6-BA、NAA和GA3的浓度分别为5.0、0.3和1.5 mg/L时）的增殖系数最高，为6.6，并且芽粗壮，长势好；处理3的增殖系数次之，为4.5；处理4的增殖系数第三，为4.3。NAA、GA3和6-BA增殖系数的极差值分别为4.3、4.0和2.5，NAA对草石蚕不定芽增殖系数的影响最大，GA3次之，6-BA的影响最小。

3 小结与讨论

植物组织培养过程中，若不能有效地对外植体进行消毒，必将影响无菌系的建立和组织培养的顺利开展。在自然生长条件下，外植体表面携带大量污染微生物，因此外植体消毒就成为组织培养过程中首要步骤[7]。不同植物在自然条件下所携带的污染微生物有所不同，所采取的消毒方式也不尽相同。所以，消毒方法的选择对于植物组织培养的成功与否起着至关重要的作用。王小敏[8]以薄荷、留兰香和椒样薄荷的茎尖、茎段和幼嫩叶片为外植体进行消毒，结果表明，最适的消毒处理为先用75%乙醇处理30 s，再用0.1% HgCl2处理10 min或0.2% HgCl2处理8 min。张秀珍[9]研究东北百里香茎段得出最适宜的消毒方法是75%乙醇30 s+0.1% HgCl2处理8～10 min。董玉梅等[10]研究了迷迭香叶片消毒方法。周川云[11]分别以紫苏种子、子叶、下胚轴和叶片为外植体，采用乙醇、HCl2、NaClO不同浓度、不同处理时间进行外植体消毒，分别获得了不同外植体适宜的灭菌条件。本试验以草石蚕不同外植体为试材，开展了HgCl2与NaClO两种消毒剂对草石蚕消毒效果的研究，结果表明，NaClO溶液比HgCl2溶液消毒效果好，以茎尖为外植体时，75%乙醇2 s+1% NaClO 10～15 min的消毒效果最好；以叶片为外植体时，75%乙醇2 s +1% NaClO 15 min的消毒效果最佳，其污染率均为0，并且未发生褐化现象。与前人研究相比，本试验通过缩短乙醇的处理时间来减少对外植体的损害，同时采用NaClO溶液以避免HgCl2消毒液难以清除问题。

在植物组织培养过程中，激素虽然用量很少，但是对植物组织培养起着显著的调控作用[12，13]。细胞分裂素类可促进细胞分裂和器官分化，促进芽分化和生长，适宜的细胞分裂素浓度对不定芽增殖起着重要作用。生长素类主要作用有促进细胞分裂和伸长，诱导愈伤组织的产生，诱导、促进生根，还会诱导某些植物胚状体的形成。赤霉素类主要作用是促进细胞生长和打破休眠，在器官形成后，可促进器官或胚状体的生长。在组织培养过程中，通常将生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类等植物生长调节剂配合使用，以诱导不定芽增殖，获得较多的增殖芽数目，提高组培苗质量。张国裕等[14]对银条芽增殖培养基进行了研究，发现MS+6-BA 4.5 mg/L+GA3 1.0 mg/L为最佳芽增殖培养基。王丹[15]研究了黄芩组织培养技术，发现黄芩丛生芽的增殖培养基以MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L为佳，且芽长的大且粗壮。沙红等[16]进行了留香兰的组织培养试验，得出其最佳增殖培养基MS+6-BA 0～0.1 mg/L+IBA 0～0.04 mg/L。史华平等[17]研究得出紫苏继代增殖培养基为MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L。本试验研究发现草石蚕不定芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 1.5 mg/L，增殖系数是6.6；本试验草石蚕不定芽增殖培养基研究结果与张国裕等[14]结果比较一致，其原因是两者试验材料相似。徐梦等[18]研究了甘露子的不定芽增殖系数为5.6，本试验比其提高了17.9%。

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