微囊藻毒素—LR诱发的甲状腺毒性对斑马鱼胚胎发育的影响

赵明明+吴琴++成厚城++丁华++王婧++彭立军+严伟

摘要：研究了微囊藻毒素-LR（MC-LR）对斑马鱼的毒性，将受精后的斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的MC-LR（0、0.6、1.2和2.4 mg/L）。结果表明，144 h后斑马鱼生长受到抑制、体长显著降低，同时其下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT）相关基因的表达模式也发生了显著变化。MC-LR可能通过调节HPT轴重要基因的表达来干扰甲状腺激素的分泌，继而干扰鱼类胚胎的生长发育。

关键词：微囊藻毒素-LR；斑马鱼；胚胎；HPT轴

中图分类号：TS212.4；TS207.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6525-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.050

随着人类社会生产力的提高及人口压力的增大，淡水水体富营养化现象日趋严重，蓝藻水华频繁发生。蓝藻水华次生代谢产生的多种毒素对人和动物的机体健康带来了巨大威胁。在已发现的各种蓝藻毒素中，微囊藻毒素（Microcystins，MC）是一种在蓝藻水华污染中产生量大、出现频率高和造成危害严重的藻毒素种类。至今已发现MC有80多种异构体[1]，在众多异构体中，毒性较大、存在较普遍、研究较详细的是MC-LR（L、R分别代表亮氨酸、精氨酸）[2，3]。

研究发现，MC对鱼类的内分泌系统具有干扰作用，可以干扰鱼类甲状腺激素分泌，引发鱼类内分泌系统紊乱以及鱼类生长发育迟缓[4，5]，然而，有关MC干扰甲状腺机能的分子机制研究还非常匮乏。甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官，其分泌的甲状腺激素具有调节动物体生长、发育、繁殖、机体代谢的重要作用。甲状腺的功能与碘吸收，激素的合成、转运，脱碘以及甲状腺激素受体有很大关系[6]。哺乳动物下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素（TRH）、刺激垂体分泌促甲状腺激素（TSH），继而TSH刺激甲状腺分泌甲状腺激素，这个体系构成了下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT轴）（图1）。HPT轴信号通路关键基因的表达是调控甲状腺功能的重要因子。

与成年鱼类不同，胚胎对MC更敏感，而且MC引起的胚胎发育迟缓效应可造成不可逆的损害，影响到各个阶段的生长发育，而引发自然水体中鱼类种群的退化。已有的MC对胚胎发育影响相关的试验多属于描述性试验，缺乏对其内在机制的揭示，也缺乏有效的预警手段。本研究拟通过研究斑马鱼HPT轴关键基因对MC染毒的响应，筛选MC干扰甲状腺机能的标志性基因，扩展对MC的甲状腺致毒机理的认识，可以评估MC对鱼类乃至人类的潜在威胁，为防治MC的内分泌毒性提供新的思路和理论依据。

1 材料與方法

1.1 材料与试剂

微囊藻毒素MC-LR购自台湾Express公司，经LC-10A型高效液相色谱（日本岛津公司）检测，纯度≥95%。

三卡因（MS-222）水溶液用于麻醉斑马鱼幼体，购自美国Sigma-Aldrich公司。其他化学试剂均为分析纯，电泳所使用的化学试剂均购自美国Biosciences公司。

1.2 斑马鱼的饲养和胚胎毒性试验

斑马鱼的饲养以及胚胎的采集参考文献[7]。将野生型斑马鱼饲养在封闭的流动体系中，维持水温（28.0±0.5） ℃，光照14 h、黑暗10 h的光照周期。斑马鱼用卤虫无节幼体饲养，每日2次。在水箱中放置大约20条雄性成鱼和10条雌性成鱼，在大量产卵后收集受精卵。受精后0.5～1.0 h，剔除发育异常的胚胎，选择正常发育的胚胎随机分组在烧杯中，每个烧杯30个胚胎。烧杯中添加浓度梯度为0、0.6、1.2和2.4 mg/L的MC-LR，并添加50 mL培养液，包含0.2 mmol/L Ca（NO3）2、0.13 mmol/L MgSO4、19.3 mmol/L NaCl、0.23 mmol/L KCl和1.67 mmol/L HEPES[8]。胚胎染毒时间持续到受精后144 h，大多数胚胎器官在这个时候已经发育完全。每个浓度设3个平行，每个平行都在玻璃烧杯中添加50 mL培养液和30个发育正常的胚胎，选择正常发育的幼体来进行后续试验。

1.3 基因表达检测

经MC-LR暴露后，收集幼体并于-20 ℃保存在TRIzol试剂中，每个处理浓度取30个幼体的混合物做3个重复进行测定。离析、纯化及测定总RNA、第一单链cDNA的合成、实时定量PCR（QPCR）等按照Li等[9]的操作执行，用TRIzol regent提取总RNA、RNase-free DNase I消解。在260 nm下估算总RNA的浓度，并通过测定260 nm/280 nm的比值来验证其质量。1%的琼脂-甲醛凝胶电泳并由溴化乙锭（EB）染色，以进一步纯化提取的总RNA。第一单链cDNA的合成依照产品说明用商业试剂盒来完成。QPCR的分析使用Chrom 4TM检测器在无菌条件下，用96孔酶标板来进行。经MC-LR处理后，对照组与试验处理组的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）在表达水平无显著差异，选择GAPDH作为内部参照物来控制数据质量。引物序列的设计使用软件Primer V3（表1）进行。热循环设置为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，40个循环；72 ℃延伸45 s。基因的倍数变化测试用2-ΔΔCt法，基因表达测定做3个重复。

2 结果与分析

2.1 MC-LR的胚胎毒性

MC-LR的暴露对斑马鱼胚胎发育造成了严重影响，MC-LR具有强烈的发育毒性。MC-LR暴露144 h后，相比于对照组[（86.7±1.68）%]的存活率，0.6 mg/L[（83.3±3.18）%]、1.2 mg/L[（82.5±3.53）%]以及2.4 mg/L[（79.8±3.29）%]暴露组的成活率均显著受到抑制（图2）。与对照组的孵化率[（86.0±0.86）%]相比，0.6和1.2 mg/L MC-LR暴露并不会显著影响斑马鱼胚胎的孵化率，但2.4 mg/L MC-LR暴露会显著抑制胚胎孵化率[（83.1±0.28）%]（图3）。3个暴露组的结果表明，MC-LR不会对胚胎心率产生显著影响（图4）。与对照组体长（4.10±0.06） mm相比，MC-LR暴露对斑马鱼生长发育造成了显著影响（图5）。结果表明，MC-LR对胚胎生长发育具有比较强的抑制效应，MC-LR对胚胎生长发育的影响是通过影响其甲状腺功能来实现的[10]，但其具体机制还有待进一步分析。

2.2 HPT軸基因表达分析

甲状腺的功能与碘吸收以及甲状腺激素的合成、转运、脱碘与受体结合息息相关，而HPT轴对此过程具有重要的调节作用，为了探寻MC-LR抑制斑马鱼胚胎生长发育的分子机制，分析了与鱼类生长发育显著相关的HPT轴相关基因的表达（图6）。CRH的转录水平在1.2和2.4 mg/L MC-LR暴露组显著上调（7.12±0.98、3.80±1.52）。CRH可刺激垂体分泌TSH，最终促进机体分泌甲状腺激素。同时检测到了TSHβ转录水平在2.4 mg/L MC-LR暴露组的显著下调（0.77±0.02）。结果表明，MC-LR暴露可能会通过抑制TSHβ的转录而抑制斑马鱼胚胎甲状腺激素的分泌，而机体为了扭转这种趋势会通过负反馈上调CRH来弥补下调的TSH。

在鱼类中，甲状腺激素可通过甲状腺激素受体调节胚胎的发育，甲状腺激素受体主要有两种类型，分别为TRα和TRβ[11]。在本试验中TRα的转录水平在2.4 mg/L MC-LR暴露组显著下调（0.53±0.02），而TRβ的转录水平在3个染毒组均无显著变化。甲状腺激素受体的不同亚型具有不同的器官表达特异性，且不同的亚型对MC-LR的响应也不相同，TRα可作为MC-LR影响鱼类甲状腺功能的生物标志物。

脱碘酶是调节鱼类甲状腺激素循环与含量的重要酶类，其主要有Deio1和Deio2两种亚型。MC-LR暴露可导致Deio1在3个染毒组的基因表达水平显著上升（依次为1.33±0.05、1.43±0.09、1.56±0.01），但对Deio2的转录无显著影响。Deio1主要在肝脏、肾脏以及甲状腺中表达，其主要作用是产生血液中的甲状腺激素T3[12]。研究表明，MCs的其他异构体可通过促进Deio1的表达来促进被抑制的T3激素分泌[13]。本试验结果表明，MC-LR可能同样具有抑制T3分泌的功能，而斑马鱼机体通过负反馈调节Deio1的表达来缓解这种不利条件。

TG与NIS的基因表达均发生显著上调，TG在3个MC-LR暴露组分别上调了1.54±0.06、1.59±0.04、1.55±0.11；而NIS在1.2和2.4 mg/L MC-LR暴露组显著上调了1.47±0.11和1.32±0.09。TG是一个分子质量为660 ku的二聚体蛋白，它在甲状腺中产生和行使功能，其主要作用为合成甲状腺激素。NIS是一种内在膜蛋白，在甲状腺细胞摄碘中起重要作用[14]。TG与NIS的过表达都可以促进甲状腺激素的分泌，这可能是机体对MC-LR抑制甲状腺激素分泌后的一种负反馈调节。

3 结论

本试验阐明了MC-LR可抑制斑马鱼胚胎生长发育，具有胚胎发育毒性，并从HPT轴相关基因表达模式的改变分析了MC-LR引发胚胎发育毒性的可能机制，丰富了MC-LR致毒机理的研究。在蓝藻水华爆发季节，藻细胞破裂后将大量MC-LR释放入自然水体中，MC-LR的胚胎发育毒性会导致渔业减产，甚至通过食物链对人体造成危害，应引发公众的关注。

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