湖北青砖茶叶片发酵前后形态变化比较

何建刚++肖长义++王春燕+李世刚++王慧+柳蔚

摘要：为了解湖北青砖茶发酵过程的变化实质，试验分析了湖北青砖茶在发酵前后叶片组织结构的变化情况，分别取发酵前后10片茶叶叶片，切片染色处理后于光镜下观察，统计叶片纤维组分与细胞胶团质组分的面积大小，分析面积变化情况。同时做叶片的透射电镜观察。结果表明，与发酵前的茶叶相比，发酵后的叶片组织较为疏松，细胞室变大，由纤维素构成的细胞壁结构明显变薄，甚至出现断裂；叶片内可见菌体明显的断面。图像分析显示，叶片组织的纤维成分减少显著，而黄色的细胞胶团质成分的含量相对增加。电镜观察发现，胞壁室内位于胶团质和细胞壁之间的空隙内有多量菌体存在。所以湖北青砖茶的发酵过程是以微生物为主导、对茶叶进行生物转化的过程，这种转化主要消耗叶片组织中的纤维素成分。

关键词：青砖茶；叶片；结构；发酵；湖北省

中图分类号：TS456.56（263） 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6480-04

长盛川湖北青砖茶是以晒毛青叶为原料，经过发酵、成化、蒸压、烘干等工艺流程制成，其中发酵过程对青砖茶的风味形成起着决定性的作用。从前人对湖南安化黑茶、云南普洱茶等黑茶系列的研究[1-3]可知，发酵过程对改变茶品质具有非常关键的作用。目前，关于青砖茶发酵本质的研究不多，对于启动发酵过程的主导因素也存在较大争议。试验从茶叶叶片的形态学变化入手，通过比较发酵前后叶片组织结构的改变，对发酵过程进行描述推测，以期为青砖茶的发酵工艺实质研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 青砖茶茶叶样品 从鑫鼎生物科技有限公司2014年6月收购的同一批青砖茶原料干茶叶片中，于发酵前后各取10片叶片。所取叶片要求形态完整、大小近似。未发酵的干茶叶片颜色淡绿，叶片伸展，全叶色泽基本一致；发酵后的干茶叶片要求发酵完整，叶片皱缩明显，颜色呈深褐色，无光泽，全叶色泽基本一致，无绿色或黄色斑块。

1.1.2 试剂 试验所用试剂有乙醇、甲醛、高碘酸、PAS（过碘酸-雪夫染色液）、Schiff试剂（品红亚硫酸试剂）、亚硫酸氢盐溶液、二甲苯、2.5%戊二醛、1%四氧化锇、硝酸铅、醋酸铀等，還有中性树胶、石蜡、环氧树脂。

1.1.3 仪器 主要有Leica DM RHC万能生物成像显微镜（德国徕卡微系统有限公司）、Olympus DP73图像采集系统（日本奥林巴斯株式会社）、DZF-6050数显真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、Microm HM340E超薄切片机（德国美康公司）、日立 7500透射电子显微镜（日本日立公司）等。

1.2 光镜切片制备

参试叶片用4%甲醛固定24 h，截取叶片中段约1 cm宽的叶片样，入乙醇脱水，石蜡包埋、切片。切片脱蜡后，进行PAS染色[4]，该染色可使含糖的组织成分显示为红色，染色方法简述如下：切片脱蜡，高碘酸溶液处理2～5 min，去离子水充分漂洗；加入Schiff试剂，室温作用15 min；入亚硫酸氢盐溶液 3次，每次2 min，流水冲洗5 min，去离子水漂洗1 min；乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 光镜观察、照相及图像分析

将制备好的玻片标本置于Leica DM RHC显微镜下进行观察，Olympus DP73图像采集系统于400倍下采集图像。每个叶片的图像采集都是从叶片中轴主脉处开始向叶片一侧方向移动，逐个视野采集图像，每个叶片采集10张。采集的图像用 Image-Pro Plus V 7.0显微镜图像分析软件进行分析，分别对图片中总着色面积、代表茶叶细胞胶团质成分的黄色部分和代表纤维素成分的红色部分进行面积测算，并计算后2个面积占总面积的百分比例。

1.4 水浸提后茶样重量的比较

将青砖茶原料干茶叶片先置于真空干燥箱内50 ℃、4 h烘干，达到干透的状态，称200 g重的茶样，将其置于装有2 L自来水的不锈钢锅中水煮，加热至沸腾，持续水煮5 min，然后换水，按上述条件再煮1次，彻底溶出茶样内的水溶性物质。煮毕后沥净残水，将处理后的茶样置真空干燥箱中50 ℃、6 h烘干，达到干透的状态，称茶样残重。发酵前的茶样和发酵后的茶样都按上述程序处理，分别做6个批次。比较2组茶样残余重量的差异。

1.5 电镜观察

用2.5%戊二醛固定干茶叶片，再用1%四氧化锇固定，常规脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，片厚约300～400 nm，置于铜网中，再分别用硝酸铅和醋酸铀复染。最后，样本用电子显微镜进行观察，并照相。

1.6 统计分析

采用t检验的方法，分别对水浸提后2组青砖茶原料干茶叶片残余重量的差异、发酵前后青砖茶原料干茶叶片组织内胶团质面积与纤维面积之比的变化和发酵前后除去水溶性物质后茶样残重的变化是否具有统计学意义进行分析。

2 结果与分析

2.1 形态观察

PAS染色后的青砖茶原料干茶叶片结构在镜下主要显示为红、黄2种颜色。由于构成细胞壁的主要物质是纤维素，纤维素又是以糖为基础的碳水化合物，所以PAS染色呈阳性，被染成红色。茶样的细胞胞体存在于胞壁腔内，为大块无定形的黄色胶质样物质所充填，这种黄色胶质样物系叶片细胞在茶叶杀青处理过程中，细胞本身的物质混合并胶质化而形成的，所以将这种物质称之为“细胞胶团质”。

试验在光镜下对未发酵的PAS染色叶片结构观察情况见图1。从图1可见，光镜下未发酵的叶片结构完整、丰满、厚实；被染成红色的胞壁框架占据着叶片组织的绝大部分区域，这些细胞壁框架结构齐全、规则，构建成厚实、紧密的组织构架。在上、下表皮之间的组织内可见大量黄色的胶团质块，它们均存在于胞壁腔内，并充满胞壁腔，周围的腔隙较小。黄色胶团颜色均匀，色泽鲜明。

试验在光镜下对发酵的PAS染色叶片结构观察情况见图2。从图2可见，光镜下已发酵的叶片结构可见红色的细胞壁明显变薄、染色变浅，甚至断裂，胞壁腔明显扩大。叶片整体细胞壁框架疏松，多处破碎、缺失，结构凌乱、松散，常有空隙存在。胞壁腔之内的黄色胶团质未见明显形态及染色变化，只是与扩大的胞壁腔在胞壁之间形成较大的间隙。在叶片的表面及内部结构中，可以看到有数量不等、分布广泛、被染成浅粉红色的圆环状结构，这些都是真菌菌丝的断面，而菌丝体的壁较薄，因为真菌菌丝体的壁主要是以单糖为原料构成的多糖成分，因此也呈PAS染色阳性，被染成红色。

2.2 图像分析

采用Image-Pro Plus V 7.0显微镜图像分析软件对青砖茶原料干茶叶片总着色面积和红、黄2种不同着色面积区域分别进行测算，结果见表1。从表1可见，发酵后，叶片以纤维素为主要构成成分的细胞壁结构面积明显减少，而由胞质混合物组成的黄色胶团质的面积出现明显变化，胶质样物在组织中的占比相对增高明显，具有显著性差异（P<0.05）。

2.3 水浸提后茶叶重量的比较

采用t检验的方法，对经过2次沸水浸提之后2组青砖茶原料干茶叶片的重量进行比较，结果见表2。从表2可见，2次沸水浸提后2组茶样的重量均明显减轻，但发酵后的茶样重量减少程度与未发酵的茶样相比显著减少，具有显著性差异（P<0.05）。

2.4 电镜观察

对发酵茶的叶片进行电镜观察，结果见图3。从图3可见，叶片组织内有大量菌体的断面，这些菌体断面在未发酵的叶片组织内很少看到。叶片组织内的菌体断面多见于细胞壁之间的间隙中，也可见于胞壁室内，但以气室内和细胞壁间隙的居多，胞壁室内相对较少（图3-A）。存在于胞壁室内的菌体只出现于胶团质与细胞壁之间，未见有菌体进入胶团质内；在菌体贴近胞壁的地方，胞壁可形成围绕菌体的“晕缺”，可能是菌体消化了胞壁而形成的（图3-B）。

3 讨论

湖北青砖茶工艺传世尽管已有近六百年的历史，但是，关于它的工艺研究并不如同属黑茶系列的云南普洱茶和湖南黑茶多见，关于湖北青砖茶渥堆发酵的本质还不清楚。尤其是在形成黑茶特有品质方面，究竟是以茶内在酶的生物氧化为主的“内发酵”为主导，还是以外部菌群的生物转化为主的“外发酵”为主导，一直存在较大争议。弄清这个问题对提高湖北青砖茶品质、促进生产工艺的标准化和现代化都有着非常重要的意义。

试验通过对发酵前后青砖茶原料干茶叶片内部结构的形态学观察，发现叶片内部结构成分变化最大的是以纤维素作为主要构成要素的细胞壁的破坏和减少，而因细胞自溶、杀青、揉捻作用由细胞自身成分发生混合、交集、凝结形成的黄色胶质样物质却没有明显的形态与数量的改变。在叶片表面及叶片结构内部均可见到一定数量的真菌菌丝结构，图像分析显示，发酵后的叶片内，由含糖的细胞壁成分占据的面积明显减少；而细胞自身所含能直接分解细胞壁的酶十分有限。因此，通过渥堆的过程，由叶片细胞内部的酶消化细胞壁的可能性非常之小[5，6]。而由发酵菌类分泌的酶类消化细胞壁，可能是造成叶片纤维素成分明显减少的主要因素[5-9]。发酵后的茶叶水溶性物质减少的原因可能是发酵菌利用了叶片内（包括胶团质）的可溶性物质，使茶叶内（包括胶团质）可溶性物质减少；也有可能是菌类的代谢产物与叶片内可溶性物质结合形成了不溶性沉淀物所致；这一结果与他人的研究结果一致[10]。

对发酵茶的叶片进行电镜观察，证明有真菌类侵袭入叶片的组织之内，并进行了大量繁殖，同时在其存在的部位对细胞壁形成溶蚀性“晕缺”。这一现象与试验里PAS染色观察和图像分析的结果一致，确认是真菌类参与了茶的渥堆发酵过程，并在发酵过程中消耗了以糖为主要构成物质的细胞壁。因此从发酵的本质来讲，湖北青砖茶与普洱茶、茯砖茶及黑茶一样，都属于以真菌为主导的发酵类茶[1-3，11-14]。

至于是何种真菌类参与了青砖茶的渥堆发酵过程，目前尚不能给出明确的答案，虽然从形态上看均是真菌的形态特征，但究竟是何种真菌还有待后续研究给予确认。弄清湖北青砖茶渥堆本质及参与发酵菌群的情况，对后续茶品质、保健功能、工艺研究等都有重要的意义。

参考文献：

[1] 付润华，齐桂年.黑茶渥堆作用的研究进展与展望[J].福建茶叶，2007（4）：6-8.

[2] 温志杰，张凌云，吴 平，等.黑茶加工中微生物作用的研究[J].茶叶通讯，2010，37（2）：26-29.

[3] 金冬双，龚淑英.黑茶的微生物作用研究进展[J].茶叶，2007， 33（4）：203-207.

[4] 贲长恩，李叔庚.组織化学[M].北京：人民卫生出版社，2001.149-151.

[5] 顾 谦，陆锦时，叶宝存.茶叶化学[M].合肥：中国科学技术大学出版社，2002.12-30.

[6] 王若仲.纤维素酶、果胶酶在茶叶加工中的研究现状[J].贵州茶叶，1998（2）：21-24，34.

[7] 尹旭敏，王雪萍，姜 波，等.茶叶加工中微生物的研究进展[J].乐山师范学院学报，2005，20（12）：79-80.

[8] 谭和平，周李华，钱杉杉，等.茶叶发酵中的酶学研究进展[J].中国测试，2009，35（1）：19-23.

[9] 齐祖同.中国真菌志（第五卷）：曲霉及其相关有性型[M].北京： 科学出版社，1997.1-3.

[10] 闫 刚，蔡 薇，高 曦.普洱茶加工过程中水浸出物含量变化研究[J].现代农业科技，2014（2）：296，299.

[11] 胡治远，刘素纯，赵运林，等.茯砖茶生产过程中微生物动态变化及优势菌鉴定[J].食品科学，2012，33（19）：244-248.

[12] 赵振军，童华荣，周 黎，等.普洱茶中真菌种群的分离与分子鉴定[J].茶叶科学，2009（6）：436-442.

[13] 周才碧，张敏星，蒋陈凯，等.黑曲霉及其与普洱茶品质关系研究进展[J].微生物学杂志，2014，34（2）：88-91.

[14] 孙 云，蒙肖虹.普洱茶渥堆发酵过程中益生菌群的研究[J].昆明理工大学学报（理工版），2008，33（5）：72-75.