精氨酸加压素对大鼠臂旁外侧核AMPA和NMDA受体亚基mRNA表达的影响

曾议锌，许丽丽， 朱云才，唐 新，罗雨晴，张 洁△，唐 瑜△

1.成都医学院 检验医学院(成都 610500)；2.成都医学院 基础医学院(成都 610500)；3.成都医学院 公共卫生系(成都 610500)

精氨酸加压素对大鼠臂旁外侧核AMPA和NMDA受体亚基mRNA表达的影响

*曾议锌1，许丽丽1， 朱云才2，唐 新2，罗雨晴3，张 洁2△，唐 瑜2△

1.成都医学院 检验医学院(成都 610500)；2.成都医学院 基础医学院(成都 610500)；3.成都医学院 公共卫生系(成都 610500)

目的 探讨精氨酸加压素(AVP)对大鼠臂旁外侧核(LPB)使君子酸(AMPA)受体和N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体mRNA表达的影响。方法 腹腔连续注射AVP1周后，采用RT-PCR技术，半定量分析大鼠LPB AMPA受体亚基GluR1、GluR2、GluR3和GluR4以及NMDA受体亚基NR2A和NR2B mRNA表达的变化。结果 与对照组比较，AVP组大鼠LPB GluR1 mRNA 表达明显上调(P<0.05), 而GluR2、GluR3和GluR4 mRNA表达虽有上调趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，NR2A和NR2B mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 AVP通过上调LPB AMPA受体，特别是GluR1亚基，而不是NMDA受体，增强LPB谷氨酸能突触传递。

精氨酸加压素；臂旁外侧核；AMPA受体；NMDA受体

精氨酸加压素(arginine vasopressin，AVP)是由下丘脑视上核和室旁核神经元合成的一种九肽物质，在中枢具有神经递质或调质作用[1]。AVP不仅是体内一种重要的内源性退热物质，而且参与正常体温调节，引起调节性低温反应[2]，其降温机制与兴奋视前区-下丘脑前部热敏神经元和抑制冷敏神经元的放电活动有关[3]。AVP的释放受环境温度影响，暴露在高温和低温环境均可提高下丘脑AVP水平[4]。

最近研究[5-7]发现，臂旁核(PBN)的外侧核，即臂旁外侧核(lateral parabrachial nucleus, LPB)是皮肤前馈温度信号上传通路的重要中继站，直接上传经脊髓传来的皮肤温度信号至体温中枢视前区，引起冷、热环境中的防御性体温调节反应，维持体温稳定。有研究[5-6]表明，阻断LPB N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体和使君子酸(AMPA)谷氨酸能受体，完全抑制皮肤冷、热刺激引起的防御性体温调节反应，提示LPB谷氨酸能递质-受体系统参与了前馈体温调节。有报道[8]称，PBN有AVP免疫阳性神经元分布，且AVP能调节LPB神经元谷氨酸能兴奋性突触传递，但AVP是否影响LPB谷氨酸能受体表达尚不清楚。本实验采用RT-PCR技术，半定量分析AVP对大鼠LPB AMPA受体亚基GluR1、GluR2、GluR3和GluR4以及NMDA受体的调节性亚基NR2A和NR2B mRNA表达的影响，为AVP可能参与低温或高温环境中的体温调节过程提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级健康雄性SD大鼠12只，体质量200～220 g，由成都达硕实验动物有限公司提供。实验分两组，即盐水对照组(n=6)和AVP实验组(n=6)。每天上午10时，腹腔注射AVP 10 μg/kg (10 μg/mL)或生理盐水1 mL/kg，连续注射1周。

1.2 主要试剂和设备

AVP为美国Sigma公司产品，用生理盐水将AVP配制成10 μg/mL的溶液, 存于-20 ℃冰箱备用。Trizol和琼脂糖由美国Invitrogen公司生产；焦碳酸二乙酯(DEPC)由Sigma公司生产； PrimeScript RT reagent Kit、PCR Master Mix和DNA Marker DL 1000均为大连宝生物工程有限公司生产；BeyoRed DNA上样缓冲液(6X)为碧云天生物技术公司产品；RNALater为Life产品；戊巴比妥钠、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯仿和无水乙醇购自成都科龙化工试剂有限公司。 PCR仪(ABI-Veriti96，ABI美国应用生物系统公司)；化学发光凝胶成像仪(Universal Hood II，美国BioRad公司)；紫外分光光度计(NanoDrop2000，美国ThermoFisher仪器有限公司)；电泳仪(JY200C，北京君意东方电泳设备有限公司)；电泳槽(JY-SPFT，北京君意东方电泳设备有限公司)；低温离心机(C2500，湖南湘仪实验仪器厂)；优普超纯水制造系统(UPH-Ⅱ-10T, 成都超纯科技有限公司)；旋涡混合器(XH-B，江苏康健医疗用品有限公司)；电子天平(PPT-A+100，美国康州HZ电子科技有限公司)；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器(SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂)；微波炉(MF-2270EQ，青岛海尔微波制品有限公司)。

1.3 引物设计与合成

根据NCBI GenBank中大鼠GluR1、GluR2、GluR3、GluR4、NR2A、NR2B和β-actin mRNA序列，采用软件Primer Premier 5.0进行引物设计(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 AMPA和NMDA受体亚基及β-actin的引物序列

1.4 取材

两组大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后，迅速断头取脑，在DEPC处理过的冰PBS液中修块，制备含LPB的脑干块，在下丘尾端横断脑干，暴露出一新月形透明区，即LPB，小心剥离LPB，迅速置于RNALater中，4 ℃过夜后，-20 ℃保存备用。

1.5 总RNA提取与定量

参照Trizol试剂说明书，在1 mL Trizol中用细玻棒将标本研磨匀浆，加入0.2 mL氯仿，离心后，吸取上清，加入0.5 mL异丙醇，离心沉淀后，弃上清，加入75 %乙醇(DEPC水配制) 1 mL，充分洗涤沉淀后，离心，弃上清，室温干燥，加入15 μL DEPC水溶解，紫外分光光度计测定RNA浓度及纯度， OD260/280=1.7～2.0。1%甲醛变性琼脂糖凝胶上进行电泳检测RNA完整性，可见明亮的28S、18S及较淡5S 3条带， 无DNA污染条带。

1.6 cDNA合成

采用gDNA Eraser去除基因组DNA后，以Oligo-dT为引物，参照PrimeScript RT reagent Kit说明书进行反转录，反转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。所得cDNA于-20 ℃储存备用。

1.7 PCR检测目的基因mRNA表达

20 μLPCR反应体系: 10 μLPCR Master Mix，上、下游引物各0.8 μL(10 μM)，cDNA 2 μL，最后加PCR Water至20 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min， 然后94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR结束后，各取10 μL PCR产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100 V×30 min)，电泳结束后使用凝胶仪成像，再用Quantity One 软件分析数据，获得各电泳条带的平均光密度值，以AMPA或NMDA受体亚基与β-actin的灰度比值表示其mRNA的相对表达含量。

推荐理由:本书是一部史学史力作，著者是中国社会史学会会长。中国社会史学科伴随着改革开放而复兴成长，逐步发展成为历史学中的一门显学。本书详细论述了新时期中国社会史研究从发轫、成长到壮大的过程，阐述这一过程的演变，全面总结各类研究成果、理论论争及学术流派的形成，呈现这一学科的繁荣景象，印证了40年来中国学术界的发展历程。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 AVP对LPB内AMPA受体亚基mRNA表达的影响

在盐水对照组，AMPA受体亚基GluR4在6只大鼠的所有样品均可见一特异性条带, 与预期扩增片断大小相符，GluR1和GluR2在1只大鼠的样品未见扩增条带，GluR3则在两只大鼠的样品未见扩增条带。腹腔连续注射AVP 1周后，AVP实验组6只大鼠LPB均检测到了GluR1、GluR2、GluR3和GluR4 mRNA，与盐水对照组比较，GluR1 mRNA 表达有明显上调(P<0.05), 而GluR2、GluR3和GluR4 mRNA表达虽有上调趋势，但差异无统计学意义(P>0.05) (图1A～D和图2)。

图1 大鼠LPB AMPA受体亚基GluR1、GluR2、GluR3和GluR4以及NMDA受体亚基NR2A和NR2B mRNA RT-PCR 产物电泳图

2.2 AVP对LPB内NMDA受体亚基mRNA表达的影响

在盐水对照组，NMDA受体的两个调节性亚基NR2A和NR2B在6只大鼠的所有样品均可见一特异性条带, 与预期扩增片断大小相符。腹腔注射AVP 1周后，在1只大鼠的样品未见NR2A扩增条带，在6只大鼠样品均检测到NR2B mRNA表达，但与盐水对照组比较，NR2A和NR2B mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)(图1E～F和图2)。

图2 AVP对LPB AMPA受体和NMDA受体亚基mRNA表达的影响

3 讨论

LPB谷氨酸能递质-受体系统除了参与前馈体温调节，还与心血管[11]等内脏活动的调节有关，因此，AVP上调LPB AMPA受体，也可能是AVP心血管活动的中枢调节机制之一。Chen 等[8]的电生理实验显示，短时间应用AVP可能通过突触前膜机制，抑制LPB谷氨酸能传递。本实验提示，长期应用AVP则可通过上调GluR1表达，代偿性增强LPB谷氨酸能突触传递。此外，AMPA受体不同亚基上调程度不均，提示AVP可能还引起了LPB神经元AMPA受体亚基重组。

[1]Raggenbass M. Overview of cellular electrophysiological actions of vasopressin[J]. Eur J Pharmacol, 2008, 583(2-3): 243-254.

[2]Yang Y L, Shen Z L, Zou Q,etal. Physostigmine-induced hypothermic response in rats and its relationship with endogenous arginine vasopressin[J]. Life Sci, 2009, 85(15-16): 586-591.

[3]Tang Y, Yang Y L, Wang N,etal. Effects of arginine vasopressin on firing activity and thermosensitivity of rat PO/AH area neurons[J]. Neuroscience, 2012, 219: 10-22.

[4]Jasnic N, Dakic T, Bataveljic D,etal. Distinct vasopressin content in the hypothalamic supraoptic and paraventricular nucleus of rats exposed to low and high ambient temperature[J]. J Therm Biol, 2015, 52: 1-7.

[5]Nakamura K, Morrison S F. A thermosensory pathway that controls body temperature[J]. Nat Neurosci, 2008, 11(1): 62-71.

[6]Nakamura K, Morrison S F. A thermosensory pathway mediating heat-defense responses[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(19): 8848-8853.

[7]Geerling J C, Kim M, Mahoney C E,etal. Genetic identity of thermosensory relay neurons in the lateral parabrachial nucleus[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2016, 310(1): R41-R54.

[8]Chen X, Pittman Q J. Vasopressin and amastatin induce V(1)-receptor-mediated suppression of excitatory transmission in the rat parabrachial nucleus[J]. J Neurophysiol, 1999, 82(4): 1689-1696.

[9]Paro F M, Almeida M C, Carnio E C,etal. Role of L-glutamate in systemic AVP-induced hypothermia[J]. J Appl Physiol, 2003, 94(1): 271-277.

[10] Chamberlin N L, Saper C B. Differential distribution of AMPA-selective glutamate receptor subunits in the parabrachial nucleus of the rat[J]. Neuroscience, 1995, 68(2): 435-443.

[11] Guo Z L, Longhurst J C, Tjen-A-Looi S C,etal. elPBN neurons regulate rVLM activity through elPBN-rVLM projections during activation of cardiacsympathetic afferent nerves[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2016, 311(2): R410-R425.

Effect of Arginine Vasopressin on the Subunit mRNA Expressions of AMPA and NMDA Receptors in Lateral Parabrachial Nucleus of Rats*

ZengYixin1,XuLili1,ZhuYuncai2,TangXin2,LuoYuqing3,ZhangJie2△,TangYu2△.

1.SchoolofLaboratoryMedicine,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 3.DepartmentofPublicHealth,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

Objective To investigate the effect of arginine vasopressin (AVP) on the subunit mRNA expressions of AMPA and NMDA receptors in lateral parabrachial nucleus (LPB) of rats. Methods The mRNA expressions of GluR1, GluR2, GluR3 and GluR4 in the AMPA receptors and those of NR2A and NR2B in the NMDA receptors were detected with RT-PCR after one-week intraperitoneal injection of AVP. Results Compared with the expressions in the control group, the mRNA expression of GluR1 in the experiment group was significantly upregulated by AVP in the LPB (P<0.05), while the mRNA expressions of GluR2, GluR3, GluR4, NR2A and NR2B weren′t upregulated significantly (P>0.05). Conclusion AVP enhances the glutamatergic transmission of LPB by upregulating AMPA receptors, especially GluR1, rather than NMDA receptors.

Arginine vasopressin; Lateral parabrachial nucleus; AMPA receptors; NMDA receptors

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20161222.1115.008.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.01.006

四川省教育厅课题(No:12ZB021);发育与再生四川省重点实验室研究基金资助课题(No:SYS14-004)；成都医学院大学生创新实验计划项目(No:CXXS201406)

R338.1

A

△通信作者: 张洁，E-mail: zhangjiefa8888@126.com；唐瑜，E-mail: yurenxiao3@netease.com