副干酪乳杆菌发酵提高羊骨酶解液体外抗氧化活性的研究

庞丰平，霍乃蕊

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

副干酪乳杆菌发酵提高羊骨酶解液体外抗氧化活性的研究

庞丰平1，霍乃蕊2*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷 030801； 2.山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

[目的]通过乳酸菌发酵提高羊骨粉酶解液的体外抗氧化活性。[方法]用副干酪乳杆菌对羊骨粉的碱性蛋白酶酶解液进行发酵，对酶解液和发酵液的各项水解指标和体外抗氧化活性进行比较。[结果]酶解液经过发酵，水解度由31.25 % 提高到50.79 %，提高了62.5%；Ca2+含量由1.25 g·L-1提高到2.75 g·L-1，提高了120.00 %；短肽含量由11.24 g·L-1提高到19.83 g·L-1，提高了 76.42 %；羟脯氨酸含量由2.13 g·L-1提高到3.25 g·L-1，提高了52.58 %。经测定DPPH清除率由39.63 %提高到43.75 %；对羟自由基和超氧阴离子的清除率分别由44.12 %、52.09 %提高到82.49 %和71.82 %。[结论]对酶解液发酵可进一步提高骨胶原蛋白的水解度，增加短肽含量，并且能促进游离Ca2+的释放,体外抗氧化活性也相应增强，研究结果为畜骨的高值利用和新型保健品的开发提供了实验支持。

羊骨酶解液； 副干酪乳杆菌副干酪亚种； 水解度； 游离Ca2+； 体外抗氧化活性

我国为畜牧大国，畜骨资源很丰富。畜骨中含有丰富的钙质，主要以羟磷灰石晶体[Ca10(PH4)6(OH)2]和无定型磷酸氢钙[CaHPO4]两种形式存在,很难被人体吸收利用[1]。畜骨中的蛋白质是主要呈三螺旋结构的胶原蛋白，很难被机体消化吸收。酶解不仅可以提高骨胶原蛋白的生物利用度，还可促使游离Ca2+的释放, 使其由骨矿形式转变为可溶性钙，利于机体的吸收[2]。酶解生成的胶原肽与释放的部分Ca2+结合可生成生物利用度更高的肽钙螯合物[3]。酶解液中的游离氨基酸和多肽等可促进发酵微生物的生长和代谢,使多肽进一步降解为短肽，并释放出更多的Ca2+。肽链越短，其生物学活性将越强[4]。副干酪乳杆菌副干酪亚种具有产蛋白酶的能力，是用于生产高钙鸡骨泥的菌种，其自身还是调节肠道微生态的益生菌。

碱性蛋白酶是水解骨胶原蛋白效果最好的酶种[5]。霍乃蕊等[6]以羊骨为底物用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制备复合酶解物,通过碳粒廓清试验、噻唑蓝法以及定量溶血法检测不同剂量酶解物对小鼠非特异性免疫、细胞免疫以及体液免疫功能的影响，探究了其免疫活性。王凯等[7]研究了羊骨胶原酶解液具有抗氧化活性，动物试验在单酶酶解的基础上得出了酶解液具有体内抗氧化活性的结论。本研究先制备羊骨粉的碱性蛋白酶酶解液，创新性的用副干酪乳杆菌副干酪亚种对酶解液进行发酵，探究发酵进一步提高水解度和短肽得率、促进Ca2+释放的可能性，并对发酵前后的抗氧化活性进行比较，为畜禽资源的进一步开发以及新型保健品的研制提供实验支持。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

1.1.1 菌种与培养基

副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei)购于中国菌种保藏中心；羊骨粉以新鲜羊骨自制；菌株活化培养基为 MRS肉汤(北京奥博星生物技术有限责任公司)；驯化培养基为不同比例的MRS培养基与羊骨酶解液的混合物。

1.1.2 试剂

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、羟脯氨酸标准品(Sigma)；碱性蛋白酶(Activity≥200 000 U·g-1；4-二甲氨基苯甲醛、异硫氰酸苯酯等其他试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

高速万能粉碎机(广州雷迈机械)；722G可见分光光度计(上海精密仪器有限公司制造)；PHS-3C 型精密pH 计(上海雷磁分析仪器厂)；台式高速冷冻离心机(香港力康生物医疗科技控股集团)；Lambda 850紫外可见分光光度计(美国PerkinElmer公司)等。

1.2 方法

1.2.1 酶解液的制备

羊骨粉浓度为9%(W/V)，90 ℃水浴杀菌15 min，冷却至酶解所需温度，将pH调至9，加入4.25%(E/S)的碱性蛋白酶，45 ℃水解325 min[4]，沸水浴10 min灭酶制得酶解液。

1.2.2 菌种驯化

菌种先在MRS肉汤中活化，然后逐渐增大MRS肉汤中羊骨酶解液的比例，使其由9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9增加至0∶10[8]，驯化时调节培养液起始pH为7，37 ℃摇床培养24 h后以1%的接种量移种。

1.2.3 乳酸菌发酵条件的确定

驯化后的菌种培养液(OD6000.965)以1%的接种量接入酶解液，调节pH，200 r·min-1震荡发酵。单因素试验时，酶解液起始pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5；温度为30、33、36、39、42和45 ℃；发酵时间为10、15、20、25、30和35 h。

1.2.4 水解指标的测定

将酶解液和发酵液离心取上清，测定小肽含量[9]，水解度[10]和羟脯氨酸(Hyp)含量[11]。

1.2.5 游离Ca2+的测定

EDTA滴定法[12]。

1.2.6 体外抗氧化活性测定

取1.5 mL发酵上清液加入1.5 mL DPPH溶液(0.1 mol·L-1) 混合均匀，室温避光反应 30 min，517 nm下测定吸光值A1，空白组以等体积 95%乙醇代替DPPH溶液，记作A2; 对照组以等体积去离子水代替样品记作A0，DPPH清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

1.3 数据分析

本研究所有试验重复3次，数据取其平均值，利用软件SPSS 19.0(SPSS Inc,Chicago,Illinois,USA)对结果进行方差分析。

2 结果

2.1 发酵条件的选择

副干酪乳杆菌在不同温度、pH、时间发酵，发酵液的水解度测定结果如图1所示。

图1 发酵温度、pH和时间对羊骨酶解液水解度的影响Fig.1 Effect of fermenting temperature,pH and time on the degree of hydrolysis of sheep bone hydrolysate

由图1可以看出，不同条件下水解度均先升高后降低，由此确定的较适发酵温度为36 ℃、酶解液起始pH为7，发酵时间为30 h。

2.2 发酵对水解指标及游离钙含量的影响

对发酵前后酶解液中的各水解指标进行测定并对结果进行比较和方差分析，由图2可以看出，副干酪乳杆菌发酵可使羊骨酶解液的水解度和游离Ca2+极显著提高(P<0.01)，同时酶解液中的短肽含量和羟脯氨酸含量也显著增加(P<0.05)。Hyp由2.13 g·L-1提高到3.25 g·L-1;游离Ca2+由1.25 g·L-1提高到2.75 g·L-1；水解度由31.25%提高到50.79%；小肽含量由11.24 g·L-1提高到19.83 g·L-1。发酵前后指标相比可知，各指标都有上升的趋势且发酵处理对Hyp、小肽含量有着显著影响(P<0.05)；对游离Ca2+、水解度有极显著影响(P<0.01)。

图2 酶解液发酵前后各水解指标及Ca2+含量的变化Fig.2 Changes of hydrolysis-related indices and Ca2+ content before and after fermentation

2.3 发酵对体外抗氧化活性的影响

对发酵前后的酶解液进行抗氧化活性的测定并进行方差分析，结果见图3。

图3 抗氧化活性各指标测定及方差分析结果Fig.3 The measuing results of each index antioxidant activity and analysis of variance

由图3可以看出，与酶解样品相比，尽管差异不显著，但发酵样品对DPPH清除率由39.63%提高到43.75%；对羟自由基和超氧阴离子的清除率极显著提高(P<0.01)，分别由44.12%、52.09%提高到82.49%和71.82%。

3 讨论与结论

对羊骨酶解液进一步发酵，可使其水解度和游离钙离子的释放量进一步增加，本研究以对羊骨粉水解效果最好的酶种碱性蛋白酶，在通过响应面法优化的工艺条件下先对羊骨粉进行水解，然后以具有蛋白酶分泌作用且经过驯化培养的副干酪乳杆菌对酶解液进行发酵，使水解度、游离Ca2+以及短肽含量分别提高了62.53%、120.00%和76.42%，其增幅很大，其测定值远远高于酶解处理或对骨泥直接发酵处理。利用枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌对猪骨泥进行双菌液态发酵[15]，水解度仅为42.5%，游离钙离子含量为1.16 g·L-1，由于没有对骨泥先行酶解，故没有达到本研究的50.79%(水解度)和2.75 g·L-1(游离Ca2+)。陈丹[16]等探讨了超微粉碎牦牛骨泥经发酵和酶解对游离钙和氨基酸态氮含量的影响，也没有对酶解和发酵进行组合研究。目前对骨泥酶解液进一步发酵处理来提高其水解度和促进钙离子释放的研究还不多，本研究还探讨了发酵对体外抗氧化活性的提高作用，并测定了骨蛋白的特征性氨基酸羟脯氨酸和短肽含量的变化。发现发酵处理后的羊骨小分子短肽比例大大提高，含有更多可以作为电子供体的底物，能够与自由基结合转化为状态比较稳定的物质终止自由活性链反应[17]，从而使羊骨泥的抗氧化活性得以提高。酶解和发酵组合处理后的骨泥，其营养价值和功能特性进一步提高。总之对酶解液进一步发酵可提高骨胶原蛋白的水解度，并且促进游离Ca2+的释放，增加短肽含量，其体外抗氧化活性也相应增强，为新型保健品的开发提供了实验支持，同时为畜骨深度开发和功能性食品研制提供了依据。

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(编辑：马荣博)

Study ofLactobacillusparacaseifermentation of sheep bone enzymatic hydrolysate to improve its antioxidant activityinvitro

Pang Fengping1, Huo Nairui2*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China； 2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

[Objective] The study was aimed to improve theinvitroantioxidant ability of sheep bone hydrolysate by fermentation with lactic acid bacteria.[Methods] The hydrolysate of sheep bone was firstly prepared by alkaline protease, then the resulted hydrolysate was fermented byLactobacillusparacaseiparacasei.Before and after fermentation, the related indices of hydrolyzing andinvitroantioxidant ability were determined. [Results] Through fermentation, the degree of hydrolyzing increased by 62.53 % from 31.25 % to 50.79 %; the level of free Ca2+increased by 120.00 % from 1.25 g·L-1to 2.75 g·L-1；the content of small peptides increased by 76.42 % from 11.24 g·L-1to 19.83 mg·mL-1; the content of hydroxyproline increased by 52.58 % from 2.13 g·L-1to 3.25 g·L-1. The scavenging ability for the free radical of DPPH increased from 39.63 % to 43.75 %；for,superoxide anion and hydroxyl radical, increased from 44.12 %,52.09 % to 82.49 % and 71.82 % respectively. [Conclusion] Fermentation can furtherly increase the degree of hydrolyzing, the level of small peptide and free Ca2+of the sheep bone hydrolysate, the in vitro antioxidant ability was also enhanced correspondingly.The result provides the experimental supporting for the development of new type healthy product and the high value apllication of animal bone.

Sheep bone hydrolysate，Lactobacillusparacaseisubsp.paracasei， Degree of hydrolysis， Free calcium ions，Invitroantioxidant activity

2016-06-01

2016-07-27

庞丰平(1991-)，男(汉)，山西临汾人，硕士研究生，研究方向：食品生物技术

*通信作者：霍乃蕊，博士，教授，Tel：0354-6289236；E-mail:tgnrhuo@163.com

国家自然科学基金(31201347)；山西省回国留学人员项目(2014-042)

TS251.94

A

1671-8151(2017)02-0126-04