眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠PI3K/Akt通路影响的实验研究*

宓 丹 王德成 陈 雪

（辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110036）

·研究报告·

眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠PI3K/Akt通路影响的实验研究*

宓 丹 王德成 陈 雪

（辽宁中医药大学附属第二医院，辽宁 沈阳 110036）

目的 通过观察眼针治疗对磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路的调控作用，探寻眼针治疗缺血性脑血管病的机制。方法 将64只SPF级Wistar大鼠分为空白组、假手术组、模型组（3 h、24 h、72 h）、眼针组（3 h、24 h、72 h）。采用改良线栓法制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型，通过眼针刺激对脑缺血再灌注损伤大鼠模型进行干预。观察眼针干预后大鼠神经功能缺损程度评分，并对各组大鼠缺血侧大脑皮层PI3K、Akt蛋白表达水平进行检测。结果 与空白组及假手术组比，模型组与眼针组大鼠出现不同程度的神经功能缺损；与模型组比眼针组24 h，72 h大鼠神经功能评分显著下降（P＜0.05）；与空白组及假手术组比，模型组与眼针组各时间点PI3K、Akt蛋白表达增加，其中眼针组与模型组各时间点比增加更显著（P＜0.05）。结论 眼针治疗能够激活PI3K、Akt信号通路，促进Akt磷酸化，发挥神经保护作用。

脑缺血再灌注 眼针 PI3K Akt

急性脑血管病以高发病率、高致残率、高死亡率成为危害人类健康的三大杀手之一。其中缺血性脑血管病占急性脑血管的80%，如何防治缺血性脑血管病一直是医学界亟待解决的问题。缺血性脑血管病的治疗主要以血管再通和神经保护为主要治疗方法。溶栓治疗虽然能使闭塞的血管再通，但因其治疗窗为症状发生后的4.5 h，仅有2%～3%的人能从中获益［1］。近年来的血管内取栓虽然延迟了治疗窗的时间，但研究显示临床结局并末优于标准内科治疗［2］。因而神经保护治疗日益受到重视，2013年美国心脏学会/美国卒中学会（AHA/ASA）联合颁布了急性缺血性卒中早期管理指南，首次积极地推荐了神经保护治疗，将神经保护剂的研究推向高潮。眼针是一种有效的治疗脑梗死的微针技术，通过刺激经络，从多方面、多靶点阻断脑缺血后的级联反应，发挥内源性神经保护作用，但其治疗机制尚末完全明确。本文通过眼针治疗对脑缺血再灌注损伤大鼠磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号传导通路的调控作用，探讨眼针治疗缺血性脑血管病的部分机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级Wistar大白鼠64只，雌雄不限，体质量（200±20）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK2010-0001。大鼠购入后，适应性饲养1周，动物室保持室温（20±2）℃，相对湿度45%，12 h昼夜节律，自由饮水，常规颗粒饲料喂养，隔天更换一次垫料。实验设计及实施过程中严格遵循动物实验的3R原则［3］。

1.2 试剂与仪器 兔抗大鼠PI3K、Akt多克隆抗体（均购自abcam公司）；HRP标记的羊抗兔二抗 （北京中杉金桥生物技术有限公司）。电泳仪（北京六一仪器设备厂）；凝胶成像分析系统，天能公司，4200SF型。

1.3 分组与造模 模型制备采用改良线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型［4］。将大鼠用10%水合氯醛麻醉后，分离颈部肌肉与血管，暴露颈内动脉，将鱼线插入颈内动脉2 cm处，2 h后将鱼线拔出。模型制备成功标准：大鼠出现对侧前爪不能完全伸展，缺血对侧眼部出现Honer证。参照Longa评分标准［5］对脑缺血再灌注模型制备成功的大鼠进行神经功能评分：1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者或实验过程中大鼠死亡的剔除，并依次补充。 假手术组大鼠术式同模型制备方式相同，区别在于鱼线插入深度为0.5～1 cm。空白组未做任何处理。将大鼠按随机数字表法分为空白组、假手术组、模型3 h组、模型24 h组、模型72 h组、眼针3 h组、眼针24 h组、眼针72 h组，共8组，每组8只。干预方法，眼针组：用31号13 mm毫针，于肝区、上焦区、下焦区、肾区，进行针刺，定位参照人体取穴方法［6］。手法：平刺，进针3 mm。留针20 min，留针期间捻转行针1次，每次1 min。治疗时机：眼针组于脑缺血2 h再灌注后即刻进行治疗，存活期间每12小时1次；眼针3 h组于取材前30 min再进行眼针治疗1次。模型组与假手术组，每12小时抓拿大鼠1次。空白组不做任何处置。

1.4 观察指标 按照规定的时间点对大鼠进行神经功能缺损评分，采用Western-blot法检测各组大鼠缺血侧大脑皮层PI3K、Akt蛋白表达水平，方法如下：在规定的时间点，将大鼠断头处死，小心去除颅骨，剥离脑组织，将缺血侧大脑皮层组织分离收集于同一个EP管中（作为一份检测样本），按组织净重与裂解液1∶10的比例加入含蛋白酶抑制剂的裂解液中，用高速电动匀浆器在冰上将大脑皮层组织制备成匀浆，于冰上静置20 min后，14000 r/min，离心15 min，收集上清液，即为缺血侧大脑组织总蛋白。采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量，以每孔上样20 μg总蛋白的上样量调整蛋白浓度及上样体积，进行垂直电泳，采用湿转法将蛋白由凝胶中转至PVDF膜，一抗（1∶500）4℃孵育过夜、二抗（1∶2000）37℃孵育2 h，充分洗膜后，加ECL发光液1 mL，于凝胶成像分析系统中采集照片，用凝胶成效系统自带软件测定目的蛋白条带和内参蛋白条带的灰度值，以目的蛋白/内参蛋白的比值作为该样本蛋白表达水平进行统计分析。

1.5 统计学处理 应用SPSS16.0统计软件分析。计量资料均以±s）表示，大鼠神经功能缺损评分，PI3K、Akt蛋白的表达水平采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较 见表1。空白组与假手术组大鼠无神经功能障碍表现。模型和眼针各组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍，模型24 h组大鼠神经功能障碍评分最高，模型72 h组大鼠神经功能障碍评分降低，但仍高于模型3 h组。眼针24 h组大鼠神经功能障碍评分最高，眼针72 h组大鼠神经功能障碍评分降低，低于眼针3 h组。与模型组同时间点相比，眼针24 h，72 h组大鼠神经功能缺损程度评分降低（P＜0.05）

表1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠神经功能缺损程度评分比较（分，±s）

与本组3 h时比较，*P＜0.05；与模型组同时间点比较，△P＜0.05。

2.2 各组大鼠PI3K、Akt蛋白的表达 见表2、图1和图2。实验结果显示：与空白组和假手术组比，模型组与眼针组PI3K、Akt蛋白表达水平显著升高。其中模型组脑缺血再灌注3 h后即出现PI3K、Akt蛋白表达水平升高，持续到24 h，72 h后PI3K、Akt蛋白升高趋势并没有进一步增加。眼针组PI3K、Akt蛋白表达水平在缺血3 h后开始升高，随着眼针治疗时间的延长PI3K、Akt蛋白表达水平进一步升高。与模型组比，眼针各时间点PI3K、AKt蛋白表达水平均高于模型组（均P＜0.05）。

表2 各组大鼠缺血侧大脑皮层PI3K、Akt蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠缺血侧大脑皮层PI3K、Akt蛋白表达比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组较，△P＜0.05。

PI3K Akt 3 h 24 h 72 h 3 h 24 h 72 h空白组 6 0.24±0.044 - - 0.24±0.043 - -假手术组 6 0.23±0.047 - - 0.23±0.041 - -眼针组 6 0.56±0.061*△0.64±0.068*△0.65±0.087*△0.52±0.087*△0.60±0.099*△64±0.99*△模型组 6 0.46±0.053*0.57±0.057*0.51±0.067*0.43±0.096*0.50±0.075*0.48±0.049*组别 n

图1 各组大鼠缺血侧大脑皮层Akt蛋白表达

图2 各组大鼠缺血侧大脑皮层PI3k蛋白表达

3 讨 论

神经保护治疗是指通过拮抗、阻滞或减慢卒中发病过程中，引起不可逆缺血性脑损伤的生物化学和分子生物学物质水平的改变，来改善疾病的预后。最初神经保护治疗并不受重视，然而研究发现溶栓后仍有迟发性神经元凋亡的发生，使神经保护剂的研究成为脑卒中治疗的热点。然而既往100多项的神经保护剂的临床实验研究均以失败告终，使神经保护治疗陷入尴尬地位。2013年美国心脏学会/美国卒中学会（AHA/ ASA）联合颁布了急性缺血性卒中早期管理指南，首次积极地推荐了神经保护治疗，将神经保护剂的研究推向高潮。眼针是一种微针技术，眼针治疗通过刺激“肝区”“肾区”“上焦”“下焦”穴位，调整脏腑功能，有效地治疗缺血性脑血管病［7］。实验表明眼针治疗可以抑制炎症反应，保护血管内皮，改善脑血流等从多方面打断脑缺血后的缺血瀑布的级联反应，发挥内源性神经保护作用［8-9］。但眼针治疗缺血性脑血管病的机制尚末完全明确。

PI3K/Akt是一条促进细胞存活和和抑制细胞凋亡的信号传导通路［10］。PI3K是细胞内重要的信号转导分子，可被生长因子、细胞因子、激素等细胞外信号激活，活化的PI3K转位到细胞膜表面，使膜上的磷酸肌醇磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PBP）、磷脂酰肌醇-3，4-二磷酸（PI-3，4-P2）和磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PI-3，4，5）发挥第二信使作用。Akt是PI3K/Akt信号传导通路的关键物质，静息状态下位于细胞质内，其活性主要通过PDK正性调节，是PI3K的重要下游效应分子，激活的Akt可以通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白从而调节细胞的增殖、分化、凋亡，促进细胞存活［11］。Noshita等研究发现，小鼠大脑中动脉闭塞1 h再灌注4 h后梗死灶周围磷酸化的Akt明显增加。而应用PI3K抑制剂能降低Akt磷酸化水平，增大梗死体积，提示信号转导通路参与了脑缺血的病理学过程［12］。雷军等研究发现白藜芦醇能促进p-Akt的表达，降低MPO活性和TNF-α含量，减轻脑梗死体积，注射PI3K抑制剂后，降低白藜芦醇对脑缺血再灌注损伤的保护作用［13］。汤諹等用反复3次关闭颈总动脉的方法复制缺血后适应模型，观察到经缺血后适应的大鼠活化水平增高Akt，神经元亚细胞结构损伤降低，同时发现神经元损伤的程度与Akt活化水平呈负相关关系［14］。以上研究证实PI3K/Akt信号传导通路在脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用。PI3K／Akt通路主要通过以下途径发挥神经保护作用。1）细胞凋亡：激活的Akt通过过磷酸化Bad、Caspase-9、Forkhead、NF-κB等基因的表达，从而发挥抑制细胞凋亡作用［15］。王晓天等研究发现脑缺血复灌后Bad与AKt结合减少，注射PI3K／Akt信号传导通路激活剂后Bad与AKt结合增多，同时Bad与Bcl-X1结合和神经元凋亡明显减少，认为激活PI3K/Akt通路可以减少Bad转位到线粒体诱导神经元凋亡，发挥神经保护作用［16］。2）促进血管新生：研究表明活化的Akt能使血管内皮细胞的eNOS的丝氨酸残基Serll77发生磷酸化并激活其酶活性，促进血管内皮生长因子诱导的内皮细胞增殖和迁移［17］。AKt磷酸化后还能促进HIF-1α的表达和活性增加，增加其转录活性，促进血管新生作用［18］。

本研究表明，脑缺血再灌注3 h后PI3k蛋白开始表达，同时Akt蛋白表达也增高，说明缺血、缺氧损伤可以激活PI3k/Akt通路，发挥内源性保护机制。PI3k、Akt蛋白表达在脑缺血再灌注损伤24 h达到高峰，之后开始下降，提示PI3k/Akt通路的激活只是脑缺血后的应激反应，不能减轻脑缺血再灌注损伤。经眼针治疗后PI3k、Akt蛋白表达明显增加增加，各时间点与模型组比两组之间差异显著。随眼针治疗时间延长PI3k、Akt蛋白表达进一步增加，同时观察到大鼠神经功能缺损明显减轻。由此我们可以推断眼针可以激活PI3k/Akt通路，促进Akt磷酸化，减少脑缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡，发挥神经保护作用。

［1］ Goldstein LB.Acute ischemic stroke treatment in 2007［J］. Circulation，2007，116（13）：1504-1514.

［2］ 毕齐.血管再通与神经保护研究——挑战与希望并存. http：//news.medlive.cn/neuro/info -progress/show -61938_ 100.html

［3］ 瞿叶清，哈惠馨，郭玉琴.3R原则在医学动物实验工作中的应用［J］.实验动物科学，2010，27（6）：84-85.

［4］ 马贤德，孙宏伟.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究［J］.中华中医药学刊，2009，27（6）：1200-1201．

［5］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke，1989，20（1）：84-91．

［6］ 彭静山.眼针疗法［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，1990：11．

［7］ 周鸿飞，黄春元，鞠庆波，等.眼针与头针对脑梗塞进行分期治疗［J］.针灸临床杂志，2006，22（4）：3-5．

［8］ 张威，马贤德，王健.眼针对脑缺血再灌注模型大鼠COX-2、PGE、IL-1β表达影响的实验研究［J］.辽宁中医杂志，2012，39（12）：2484-2486.

［9］ 宓丹，马贤德，王健.眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠模型VEGF/VEGFR系统表达的影响［J］.山东大学学报：医学版，2013，58（2）：21-26．

［10］胡志明，刘金霞，陶胜忠.脑及治疗ATM及PI3K的表达及意义［J］.中国临床神经外科杂志，2015，20（1）：31-33.

［11］Wu DN，Pei Ds，Wang Q，el a1.Dovavregulmion ofPⅡN by soditma orthovamdme inhibits asla activation via P13-K/Akt dtring cerebral ischemia in rat hiplx）carrcus［J］.Neurosci Lelt，2006，404：98-102．

［12］Noshita N，Lewen A，Sugawara T，et al.Evidence of phosphorylation of AKt and neuronal survival after transient focal cerebral ischemia in mice［J］.Cereb Blood Flow Metal，2001， 21：1442-1450.

［13］雷军，荣涂献坤，张华斌，等.白藜芦醇通过激活PI3/AKt信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注损伤［J］.中国临床神经外科杂志，2016，21（7）：425-429.

［14］汤諹，李树清，李凡.缺血后适应对树鼩海马CA1区神经元Akt信号转导调控的机制研究［J］．中国病理生理杂志，2011，27（3）：560-565．

［15］潘蓉蓉，金永喜，朱文宗.P13K／AKT信号通路介导的细胞凋亡机制研究进展［J］.浙江中西医结合杂志，2013，23（1）：70-71．

［16］王晓天，刘晓梅，尤红娟，等.P13K／AKt通路在脑缺血Bad线粒体转位中的神经保护作用［J］.徐州医学学报，2014，34（11）：715-719.

［17］Zhou Y，Fathali N，Lekic T，et a1．Remote limb is．chemic postconditioning protects against neonatal hypoxic-ischemic brain injury in rat pups by the opioid receptor/AKT pathway［J］.Stroke，2011，42（2）：439-444．

［18］李丽华，屈艺，毛萌，等.新生鼠缺氧缺血性脑损伤时三磷酸肌醇激酶信号通路与缺氧诱导因子-1α的调节［J］.中国修复重建外科杂志，2008，22（9）：1102-1107.

Effects of Eye Acupuncture on PI3K/AKt Signaling Path after Cerebral Ischemia-reperfusion Injury inRats

MI Dan，WANG Decheng CHEN Xue. The Second Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Liaoning，Shenyang 110036，China.

Objective：To explore the mechanism of eye acupuncture on cerebral ischemia-reperfusion rats by observing its effects on PI3K/Akt signaling path.Methods：62 SPF grade Wistar rats were divided into 8 groups：the blank group，Sham operation group，the model groups with 3 h，24 h and 72 h，the eye acupuncture groups with 3 h，24 h and 72 h.Improved suture-occluded method was adopted to establish cerebral ischemia-reperfusion model，and eye acupuncture was applied to observe nerve function defect score and to detect the level of PI3K，Akt protein expression in ischemic cOrtex of rats in specific time point.Results：Compared with the blank group and sham operation group，model groups and eye acupuncture groups had different degrees of nerve function defect.Compared with the model group，nerve function defect score of the eye acupuncture 24 h and 72 h groups decreased obviously（P＜0.05）.Compared with the blank group and sham opration group，the level of PI3K and Akt p53 protein expression of model groups and eye acupuncture groups increased.Compared with the model group，the expressions of PI3K and AK of eye acupuncture group also markedly increased at each point（P＜0.05）. Conclusion：Eye acupuncture has neuro-protective effect on cerebral ischemia-reperfusion injury through the activation of PI3K/Akt signaling pathway and can promote the phosphorylation of Akt.

Cerebral ischemia-reperfusion；Eye acupuncture；PI3K；Akt

R245.32+9

A

1004-745X（2017）02-0212-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.02.008

2016-11-08）

辽宁省科技厅研究项目（2014020162）