43株甘肃临床分离非结核分枝杆菌分类鉴定

张 鑫，蔡 静，姜 元，魏黛珏，李 凯，同重湘

43株甘肃临床分离非结核分枝杆菌分类鉴定

张 鑫，蔡 静，姜 元，魏黛珏，李 凯，同重湘

目的 了解甘肃当前临床流行的非结核分枝杆菌(NTM)的病原谱特点及其主要NTM种类，为指导临床诊疗、有效防治NTM肺病提供参考依据。方法 收集2012年～2014年来源于甘肃省不同地区的875株临床分离分枝杆菌菌株，经PNB/TCH方法初步鉴定为疑似NTM菌株，采用16S rRNA基因测序技术进行菌种鉴定。结果 875株分枝杆菌临床分离菌株中分离出疑似NTM菌株46株。经16S rRNA基因序列分析鉴定，43株为NTM，3株为诺卡氏菌。43株NTM菌株分别为胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、塞内加尔分枝杆菌、鸟分枝杆菌、戈登氏分枝杆菌、楚尔盖分枝杆菌、罕见分枝杆菌、偶然分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。其中，胞内分枝杆菌有31株，占总NTM菌株数的72.09%。结论 甘肃省非结核分枝杆菌群以胞内分枝杆菌为主，应用16S rRNA基因序列分析鉴定方法能准确鉴定出NTM菌种，为临床诊治提供依据。

非结核分枝杆菌；PNB/TCH鉴别培养；16S rRNA基因序列分析

非结核分枝杆菌(Non-tuberculousMycobacteria，NTM)是除结核分枝杆菌类群和麻风分枝杆菌之外的一类分枝杆菌，广泛存在于各种自然环境中，目前已发现170多种[1-2]。NTM是一类致病菌或条件致病菌[3-4]，近年来由NTM引起的疾病疫情逐渐呈上升趋势，现已引起全世界范围的普遍关注[5-6]。NTM感染与结核病具有相似的临床表现，但其预防治疗与结核病却明显不同，这对于临床诊断的准确性带来极大考验[7]。所以，临床分枝杆菌感染的菌种鉴定的准确性，对于治疗肺部感染等疾病具有重要的参考和指导依据[8]。因此，本研究收集了2012-2014年来自甘肃省不同地区就诊于兰州市肺科医院临床分离的875株分枝杆菌菌株，采用PNB/TCH生长试验方法初步筛选出疑似NTM的菌株，采用16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定，以便了解甘肃地区NTM病原谱型分布和优势菌种，为NTM疫情的预防控制提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集2012-2014年兰州市肺科医院经Bactec MGT960系统培养阳性分枝杆菌菌株875株。结核分枝杆菌标准参考菌株H37Rv由中国药品生物制品检定所提供。

1.1.2 培养基 菌株培养采用改良罗氏培养基(L-J培养基)，菌株鉴定培养基采用PNB/TCH鉴别培养基，均由珠海市银科医学工程股份有限公司提供。

1.1.3 试剂与仪器 细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，DNA胶回收纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)，ExTaqDNA聚合酶(大连 TaKaRa)，PCR仪(美国 Bio-Bad)，凝胶成像仪(美国 Bio-Bad)。

1.2 研究方法

1.2.1 NTM菌株筛选 将经Bactec MGT960系统培养阳性的875分枝杆菌菌液接种于PNB培养基、TCH培养基及L-J培养基上，37 ℃培养4周，记录菌落的生长情况。其中PNB和TCH培养基均生长的菌株初步判定为非结核分枝杆菌；PNB不生长、TCH生长或不生长的菌株初步判定为结核分枝杆菌复合群[9]。

1.2.2 菌株DNA提取及16S rRNA基因片段PCR扩增 将上述初步筛选出的疑似NTM菌株接种于L-J液体培养基中，37 ℃培养至生长对数期，在6 000 r/min离心10 min，留菌体沉淀，采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。引物由上海生工生物有限公司合成(上游引物：5′-GCTGGCGGCGTGCTTAACA-3′，下游引物：5′-ATGACGTGACGGGCGGTGT -3′)，以提取总DNA为模板，对其16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR扩增反应总体系为25 μL：上下游引物各(10 μmol/μL) 1 μL，模板 2 μL，Premix ExTaqDNA聚合酶12.5 μL，补加ddH2O至25 μL。反应参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性45 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环，最后72 ℃总延伸10 min。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并用DNA胶回收试剂盒进行切胶回收纯化，将纯化后的PCR扩增产物送至华大基因公司测序。

1.2.3 16S rRNA基因序列系统发育分析 获得测序结果后提交序列，将所测序列在NCBI的GenBank数据库中，用BLAST程序与已知序列进行同源性比对分析。并定义16S rRNA基因序列相似性低于97%划分为不同的分类单元(OTU)[10]。利用MEGA5.0软件的Neighbor-Joining方法进行系统发育树的构建(自展值为1 000次)。

2 结 果

2.1 PNB/TCH鉴别培养结果 经采用PNB/TCH生长试验方法对875株分枝杆菌菌株初步筛选鉴定，其中在PNB/TCH培养基均生长的菌株有46株，初步鉴定为NTM菌群；PNB培养基上不生长、TCH培养基上生长或不生长的菌株有829株，鉴定为结核分枝杆菌复合群。

2.2 NTM菌株DNA提取及16S rRNA基因扩增 将上述初步鉴定为NTM菌株进行总DNA基因组的提取，并用1%凝胶琼脂糖进行电泳检测(如图1A)。可以看出，NTM菌株提取的DNA基因组片段长度都均约在23.1 kb左右，完整性较好。PCR扩增产物长度约为580 bp左右，且目的条带单一，具有较好的扩增效果(图1B)。

注：A图中M为λDNA/ HindⅢMarker；B图中M为DNA Marker DL2000.A: M is λDNA/ HindⅢ Marker; B: M is DNA Marker DL2000.图1 部分NTM菌株的总DNA提取(A)和16S rRNA基因片段的PCR扩增电泳检测图(B)Fig.1 Partial results of strain NTM total DNA extraction (A) and 16S rDNA gene PCR amplification electrophoresis figure (B)

2.3 16S rRNA基因序列分析 通过16S rRNA基因序列同源性比对结果分析显示，46株疑似NTM菌株中43株为NTM菌株，3株为诺卡氏菌。其中，43株NTM菌株中有31株属于胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，占NTM菌株总数的72.09%；3株为堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，占NTM菌株总数的6.97%；鸟分枝杆菌(M.avium)、塞内加尔分枝杆菌(M.senegalense)和戈登氏分枝杆菌(M.gordonae)均为2株；楚尔盖分枝杆菌(M.szulgai)、罕见分枝杆菌(M.peregrinum)和偶然分枝杆菌(M.fortuitum)均为1株。其中，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)为NTM菌株类群的优势种群(见表1)。

表1 16S rRNA基因序列相似性分析鉴定NTM菌种结果
Tab.1 Results of NTM species identification with similarity analysis of partial 16S rRNA gene sequences

菌株Strain代表菌株编号Representativestrainnumber菌株数Numberofstrains同源序列Homologoussequences同源相似性(%)ThesimilarofHomologous(%)比例(%)Proportion(%)胞内分枝杆菌M.intracellulareS131S.flavogriseus(KF991636)98.2,99.472.09堪萨斯分枝杆菌M.kansasiiS23S.xantholiticus(EU570689)98.4,99.76.97鸟分枝杆菌M.aviumS32M.avium(LT558822)98.3,99.84.65塞内加尔分枝杆菌M.senegalenseS42S.niveoruber(EU570685)98.5,99.44.65戈登氏分枝杆菌M.gordonaeS52S.bacillaris(KC493993)99.1,99.34.65楚尔盖分枝杆菌M.szulgaiS61S.europaeiscabiei(HQ441821)99.62.33罕见分枝杆菌M.peregrinumS71S.griseoplanus(KF876898)99.82.33偶然分枝杆菌M.fortuitumS81S.roseus(EF017710)98.92.33

图2 基于16S rRNA基因序列构建的代表菌株的系统发育树Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of reference strains

3 讨 论

在临床医学上，以生理生化特性试验为主的菌种鉴定技术是分枝杆菌菌种鉴定的主要方法，但其由于操作的复杂性和耗时等缺点，鉴定结果也不准确。目前，随着分子生物学技术的快速发展，人们对于NTM的研究也不断深入，基于基因技术对NTM菌株进行鉴定已成为快速检测分枝杆菌的重要手段。通过研究发现，分枝杆菌的16S rRNA基因片段中含有保守区和高变区，两区特定位置上的核苷酸差异可将分枝杆菌鉴定至种水平[11-12]。采用16S rRNA基因扩增技术，只需对NTM的16S基因进行扩增测序并与基因数据库中的同源序列进行对比分析，就能快速的进行菌种鉴定[13]。因此，在临床上分枝杆菌菌株的快速准确鉴定至种水平对于分枝杆菌感染的流行病学和临床诊断治疗都具有十分重要的意义[14]。

近年来，有关于我国NTM感染的报道研究较多，且逐年呈上升趋势[15]。但从总的趋势上来说，国内NTM流行分布主要为南方地区高于北方地区，沿海地区高于内地地区，气候温和地区高于寒冷地区等特点[16]。而本研究中NTM的临床分离率为4.83%，远低于福建省NTM和宁波地区NTM流行状况调查分析临床分离率的10.2%和17.48%[16-17]，这也正好符合我国NTM流行的分布特征。本研究通过NTM菌株的16S rRNA基因片段序列分析，结果显示：从875株临床分离株中鉴定出46株疑似NTM菌株，通过16S rRNA基因序列分析鉴定，43株为NTM菌株和3株诺卡菌，其中胞内分枝杆菌有31株，占NTM总数的72.09%，这与2012年湖南地区225株NTM基因芯片分型结果主要以胞内分枝杆菌为主的研究结果相近[18]。由于胞内分枝杆菌是属于一种致病性的NTM菌株，分布范围较广。它主要可以引起慢性肺部感染，继发感染于AIDS患者的情况则尤为突出，呈播散性感染。但近几年来，研究学者们发现，结核肺病的主要病原体是胞内分枝杆菌，也是引发人肺结核病的重要病原菌之一。因此，由胞内分枝杆菌引起的疾病已引起了全世界范围内的极大关注。本研究NTM菌株鉴定结果中有3株为诺卡菌，这说明部分诺卡菌感染与结核病具有相似的临床表现。这也印证了传统培养方法鉴定的不准确性，而采用16S rRNA基因扩增技术进行菌种鉴定对于分枝杆菌感染的临床诊断治疗更具有准确性。另外，本研究还发现，本省各地区常见NTM菌群与我国类似，优势菌群顺位有一定差异，但未深入进行研究其地理分布信息差异，今后需进一步深入研究。

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Species identification on 43 clinical non-tuberculosisMycobacteriaisolates from Gansu Province, China

ZHANG Xin, CAI Jing, JIANG Yuan, WEI Dai-jue, LI Kai, TONG Chong-xiang

(LanzhouPulmonaryHospital,Lanzhou730046,China)

To understand pathogen spectrum of nontuberculosisMycobacteria(NTM) and the dominant NTM in Gansu Province and provide the scientific basis for the effective prevention and treatment of NTM diseases, 875Mycobacteriaisolates were collected from 2012 to 2014 in Lanzhou Pulmonary Hospital, NTM species were identified by means of PNB/TCH differentiate medium and 16S rRNA gene sequence analysis respectively.Forty-six isolats of NTM were identied from 875 PNB/TCH.Then with 16S rRNA gene sequence analysis,the NTM strains were identified to 3 strains ofNocadiaand 43 strains of NTM, includingM.intracellulare,M.kansasii,M.avium,M.senegalense,M.gordonae,M.szulgai,M.peregrinumandM.fortuitum. Among them, there were 31 strains ofM.intracellulare, which accounted for 72.09% of the total number of NTM strains. The dominant nontuberculosisMycobacteriain Gansu Province were mainlyM.intracellulare. The application of molecular biology can rapidly and accurately identify the species of nontuberculosisMycobacteria, and can provide relevant evidence for clinical diagnosis and therapy.

non-tuberculosisMycobacteria; PNB/TCH; 16S rRNA gene sequence analysis

Tong Chong-xiang, Email: 1607128879@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.015

同重湘，Email：1607128879@qq.com

甘肃省兰州市肺科医院，兰州 730046

R378

A

1002-2694(2017)02-0173-05

2016-11-07 编辑：张智芳

兰州市科技计划项目(No.2014-ZD-01)资助

Funded by the Science and Technology Project of Lanzhou (No. 2014-ZD-01)