γ-干扰素及外源性吲哚对泌尿生殖道沙眼衣原体生长影响的探讨

刘志超，刘原君，刘建刚，刘全忠

γ-干扰素及外源性吲哚对泌尿生殖道沙眼衣原体生长影响的探讨

刘志超1，刘原君2，刘建刚1，刘全忠2

目的 探讨外源性吲哚及γ-干扰素对国内沙眼衣原体优势株E-UW-5/Cx型标准株及临床株生长的影响，并与国外优势株D-UW-5/Cx进行比较。方法 分别用DMEM-10、DMEM-10加5 ng/mL 重组人γ-干扰素和 DMEM-10加5 ng/mL 重组人γ-干扰素及50 μmol外源性吲哚三种细胞培养液培养沙眼衣原体至48 h，甲醇固定后计数包涵体，观察γ-干扰素及外源性吲哚对E型、D型沙眼衣原体标准株及临床株生长的影响。结果 DMEM-10+IFN组衣原体包涵体计数明显低于DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组，差异有统计学意义，P<0.05；DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组包涵体计数差异无统计学意义；E型标准株、临床株与D型标准株、临床株之间差异无统计学意义，P>0.05。结论 在IFN-γ作用下，沙眼衣原体的生长繁殖受到明显抑制，加入外源性吲哚后, 泌尿生殖道沙眼衣原体可以逃逸IFN-γ介导的清除作用，恢复其感染活力。

沙眼衣原体； Hela细胞；γ-干扰素；外源性吲哚

泌尿生殖道沙眼衣原体感染(genital chlamydial infections，GCI)是目前世界范围内最为流行的性传播疾病，已经成为较严重的公共卫生问题，其临床表现复杂，迁延难愈，大约10%～15%的患者在治疗期间出现再感染和持续感染[1]。衣原体持续感染[2]是指衣原体在不利生长的条件下，逃逸宿主的免疫防御而产生的一种可逆状态，但并不是所有感染衣原体的患者都会出现持续感染，临床发现在相同环境下，女性中更容易造成Ct的慢性炎症并导致更为严重的后果。这就提示女性生理结构及激素水平在疾病发展中起着一定的作用。为了进一步探讨沙眼衣原体持续感染形成的机制，我们在既往研究的基础上，探讨γ-干扰素及外源性吲哚对国内沙眼衣原体优势株E-UW-5/Cx型标准株及临床株生长的影响，以期发现沙眼衣原体持续感染的可能机制，为临床提供诊疗帮助。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 沙眼衣原体菌株 沙眼衣原体E-UW-5/Cx型、D-UW-5/Cx标准株由美国马里兰大学衣原体研究中心提供，临床株由天津医科大学性传播疾病研究所提供并保存。

1.1.2 Hela细胞(人宫颈癌细胞起源) 购自中国医学科学院皮肤病研究所，并由天津市性传播疾病研究所细胞培养室保存。

1.1.3 DMEM-10细胞培养液 DMEM粉9.6 g、NaHCO32 g加蒸馏水至1 000 mL，用直径为0.2 μm的滤器抽滤DMEM液，分装至无菌瓶中，并用封口膜密封。

1.1.4 吲哚 0.023 43 g吲哚溶于200 mL甲醇，形成10 000 μmol/L indole；按倍数稀释，形成50 μmol/L indole。

1.1.5 5 ng/mL 人重组IFN-γ制备：100万U人重组IFN-γ(含60 ng IFN-γ)用PBS缓冲液溶解至12 mL。

1.2 实验方法

1.2.1 用DMEM-10细胞培养液培养Hela细胞48 h。

1.2.2 将生长状态良好的Hela细胞传至6孔板，继续培养24 h，形成致密单层。

1.2.3 将感染率为3-5MOI[13]的沙眼衣原体E型、D型标准株及其临床株分别接种至不同的6孔板[4]。

1.2.4 32 ℃，3 000 r/min,离心1 h，5%CO237 ℃孵箱静置2 h后，分别用DMEM-10、DMEM-10加5 ng/mL 重组人γ-干扰素(简称DMEM-10+IFN)和 DMEM-10加5 ng/mL 重组人γ-干扰素及50 μmol外源性吲哚(简称DMEM-10+IFN+IND)3种细胞培养液培养沙眼衣原体菌株。

1.2.5 继续培养48 h后，分别收集上清液，并用冰双蒸水溶解细胞，收集上述全部混合液，再接种至新的Hela细胞6孔板，按上述方法继续培养48 h。

1.2.6 包涵体计数方法 细胞培养48 h后，弃去培养板中液体，风干后甲醇固定15 min，用卢戈氏碘液染色，计数不同培养液作用下的包涵体数目，每孔计数30个视野(×400倍镜下)取均值。临床株采用相同的计数方法。

1.3 统计学方法 采用SPSS18软件进行分析，各组数值间采用q检验，P<0.05，差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3种不同培养液作用下沙眼衣原体E-UW-5/Cx临床株的包涵体数目及细胞形态。从图1可见，与正常细胞相比，外源性干扰素及吲哚干预后的细胞形态正常，状态良好；图1a、图1c的包涵体数目明显多于图1b。

2.2 DMEM-10、DMEM-10+IFN和DMEM-10+IFN+IND对沙眼衣原体E型标准株和临床株生长的影响。DMEM-10+IFN组衣原体包涵体计数明显低于DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组，差异有统计学意义，P<0.05；DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组包涵体计数差异无统计学意义P>0.05,见表1。

2.3 DMEM-10、DMEM-10+IFN和DMEM-10+IFN+IND对沙眼衣原体D型标准株和临床株生长的影响。DMEM-10+IFN组衣原体包涵体计数明显低于DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组，差异有统计学意义，P<0.01；DMEM-10组和DMEM-10+IFN+IND组包涵体计数差异无统计学意义P>0.05；E型标准株、临床株与D型标准株、临床株之间差异无统计学意义，P>0.05，见表2、表3。

a b c注：图中褐色深染的即为沙眼衣原体的包涵体。图1a为DMEM-10组(正常)的包涵体；图1b、图1c分别为DMEM-10+IFN组及DMEM-10+IFN+IND组的包涵体。Note:The brown stains in the picture are the inclusion body of C. trachomatis. Figure 1a is the inclusion body of DMEM-10 (normal). Figure 1b and figure 1C is the inclusion bodies of group DMEM-10+IFN and group DMEM-10+IFN+IND respectively.图1 不同培养液作用下的包涵体数目(× 400)Fig.1 The number of inclusion bodies in different culture media (× 400)

表1 γ-干扰素及外源性吲哚对E型标准株及临床株生长的影响
Tab.1 The effect of γ-interferon and exogenous indole on the growth of type E standard and clinical strains

组别groups全孔包涵体的平均数量theaveragenumberofinclusionsinthewholeporeE型标准株typeEstandardstrainsQPE型临床株typeEclinicalstrainsQPDMEM-1081.97±7.64▲45.3536<0.0566.97±3.84▲60.8905<0.05DMEM-10+IFN28.33±5.04▽1.1668>0.0525.87±3.24▽2.1334>0.05DMEM-10+IFN+Ind83.35±6.49▲46.5205<0.0568.41±3.97▲63.0239<0.01

注：3组包涵体均数两两比较，进行q检验，▲表示P<0.05，▽表示P>0.05。

Note: the 3 groups of inclusion bodies were pairwise comparison，carry outqtest，▲indicatesP<0.05，▽indicatesP>0.05

表2 γ-干扰素及外源性吲哚对D型标准株及临床株生长的影响
Tab. 2 The effect of γ-interferon and exogenous indole on the growth of type D standard and clinical strains

组别groups全孔包涵体的平均数量theaveragenumberofinclusionsinthewholeporeD型标准株typeDstandardstrainsQ值QP值PD型临床株typeDclinicalstrainsQ值QP值PDMEM-1065.87±7.20▲29.3624<0.0564.57±5.12▲43.2044<0.05DMEM-10+IFN25.62±6.17▽2.3052>0.0523.91±5.03▽1.7639>0.05DMEM-10+IFN+Ind69.03±8.90▲31.6676<0.0166.23±5.31▲44.9683<0.05

注：3组包涵体均数两两比较，进行q检验，▲表示P<0.05，▽表示P>0.05。

Note: the 3 groups of inclusion bodies were pairwise comparison，carry outqtest，▲indicatesP<0.05，▽indicatesP>0.05

表3 γ-干扰素及外源性吲哚对E型、D型标准株及临床株衣原体生长的影响
Tab.3 The effect of γ-interferon and exogenous indole on the growth of type D、E standard and clinical strains

组别groups全孔包涵体的平均数量TheaveragenumberofinclusionsinthewholeporeE型标准株typeEstandardstrainsE型临床株typeEclinicalstrainsD型标准株typeDstandardstrainsD型临床株typeDclinicalstrainsDMEM-1081.97±7.64▲66.97±3.84▲65.87±7.20▲64.57±5.12▲DMEM-10+IFN28.33±5.04▽25.87±3.24▽25.62±6.17▽23.91±5.03▽DMEM-10+IFN+Ind83.35±6.49▲68.41±3.97▲69.03±8.90▲66.23±5.31▲

注：3组包涵体均数两两比较，进行q检验，▲表示P<0.05，▽表示P>0.05。

Note: the 3 groups of inclusion bodies were pairwise comparison，carry outqtest，▲indicatesP<0.05，▽indicatesP>0.05

3 讨 论

沙眼衣原体是一种专性细胞内寄生性病原体，进入机体后能诱发机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答，其中以CD4+Thl细胞介导的细胞免疫应答占优势，可增强宿主对微生物感染尤其是细胞内病原体的免疫性和防御功能，特别是Thl细胞分泌的γ 干扰素在疾病的发生、发展中起关键作用[3-6]。

沙眼衣原体为色氨酸营养缺陷体，其生长繁殖需从宿主细胞中获得色氨酸。本研究通过模拟体内环境γ-干扰素及吲哚浓度[7]，分别用DMEM-10、DMEM-10+IFN和DMEM-10+IFN+IND三种细胞培养液培养国内沙眼衣原体优势株E-UW-5/Cx型标准株及临床株，并与国外优势株D-UW-5/Cx进行比较，统计后发现DMEM-10+IFN组衣原体包涵体计数明显低于DMEM-10组，差异有统计学意义，说明加入浓度为5 ng/mL 人重组IFN-γ后，沙眼衣原体的生长繁殖明显受到抑制，其可能机制是IFN-γ诱导人宿主细胞产生吲哚胺2,3二氧化酶(IDO)，降解内源性色氨酸，剥夺沙眼衣原体复制所需的营养，从而抑制衣原体的生长，因而持续暴露于IFN-γ中有可能消除Ct感染[8-9]。而DMEM-10+IFN+IND组包涵体数目则与DMEM-10组差异无统计学意义，说明IFN-γ诱导人宿主细胞产生IDO，降解内源性色氨酸，抑制沙眼衣原体生长，使网状体(RB)发生变异，发展成无感染性的非典型形态的RB，而补充外源性色氨酸(吲哚)后，非典型形态的RB又能恢复原生长活性，继续以二分裂方式进行分裂、繁殖，释放具有感染性的原体(EB)，导致持续感染[10]，未影响其生长繁殖活性。

有研究证明，在给予IFN-γ时，如果增加外源性吲哚会使其恢复到衣原体的正常发育周期，这种拯救性行为只发生在Ct的生殖器菌株中，这可能与Ct生殖器菌株的亚型拥有某些功能性色氨酸合成酶的基因[11]有关，该基因可使泌尿生殖道菌群分泌的吲哚转变成色氨酸，使衣原体逃脱IFN-γ的杀伤作用，形成持续感染。在女性尿道中存在多种可以产生吲哚的微生物, 包括梭菌属、消化链球菌属、革兰阴性需氧菌(大肠杆菌) 等, 而男性尿道中吲哚产生相对较少，因此女性更容易造成Ct的慢性炎症并导致更为严重的后果。

本研究结果显示泌尿生殖道沙眼衣原体天津地区优势株E型标准株、临床株在给予IFN-γ时，其包涵体数目比正常组(无干扰素组)明显减少；在加入外源性吲哚后，衣原体生长又有明显的恢复，包涵体数目与正常组差异无统计学意义。说明当外源性吲哚存在时, 泌尿生殖道沙眼衣原体可以逃逸IFN-γ介导的清除作用，利用吲哚作为底物来合成生长所必需色氨酸，从而可以快速的分裂、繁殖，从网状体转变为有感染性的原体。这与Caldwell 等[7]研究： 在0.1 ～1.0 μmol低浓度吲哚存在时,Ct就可以逃逸IFN-γ介导的清除作用并产生有感染性的原体, 维持致病能力相一致。

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Effect of interferon-γ and exogenous indole on the growth ofChlamydiatrachomatis

LIU Zhi-chao1, LIU Yuan-jun2，LIU Jian-gang1，LIU Quan-zhong2

(1.DepartmentofDermatology,AffiliatedHospital,TaishanMedicalUniversity,Taian271000,China;2.DepartmentofDermatology,GeneralHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300052,China)

We investigated the effects of γ-interferon and exogenous indole on the growth of domestic dominant standard strains and clinical strains ofChlamydiatrachomatisE-UW-5/Cx, and compared with the dominant strains of D-UW-5/Cx abroad. We used DMEM-10, DMEM-10 containing 5 ng/mL recombinant human interferon gamma (referred to as DMEM-10+IFN) and DMEM-10 containing 5 ng/mL recombinant human interferon gamma and 50 μM exogenous indole (referred to as DMEM-10+IFN+IND) to cultureC.trachomatis, and then we fixed it with methanol to count inclusions after 48 hours, observing the influence of r-interferon and exogenous indole on the growth ofC.trachomatisstandard strains(E, D) and clinical strains. Results showed that the count ofChlamydiainclusion bodies in DMEM-10+IFN group was significantly lower than others (P<0.05); no significant difference was found (P>0.05) between the count of DMEM-10 group between DMEM-10+IFN+IND group. There were no significant difference between the E and D standard or clinical strains (P>0.05). Under the effect of IFN-γ, the growth of domestic dominant strain E-UW-5/CxC.trachomatiswas significantly inhibited. After adding exogenous indole,C.trachomatiscan escape the scavenging activity of IFN-γ to restore the infection vitality.

Chlamydiatrachomatis; Hela cell; interferon-γ; exogenous indole

Liu Quan-zhong, Email: liuquanzhong@medmail.com.cn

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.008

山东省自然科学基金项目(No.ZR2011HL009)和泰安市科技发展计划项目(No.2016NS1167)联合资助

刘全忠，Email:liuquanzhong@medmail.com.cn

1.泰山医学院附属医院，泰安 271000； 2.天津医科大学总医院，天津 300052

R374

A

1002-2694(2017)02-0131-05

2016-09-26 编辑：梁小洁

Supported by the Shandong Provincial Natural Science Foundation, China(No.ZR2011HL009)and the Tai'an Science and Technology Development Program(No.2016NS1167)