广州市活禽批发市场禽流感病毒污染状况调查

张海冰，杨穗娟，彭南秀，沈 丹，薛 红，何日文，陈 裕，胡永辉，钟锦辉，林 鸿，钟卓玲，殷 实，张 桢，林钟婷，邓小敏，彭 聪，段晓冬，郑丽兰，张海明

（1. 广州市动物疫病预防控制中心，广东广州 510440；2. 广州市农业局，广东广州 510405）

广州市活禽批发市场禽流感病毒污染状况调查

张海冰1，杨穗娟1，彭南秀1，沈 丹1，薛 红1，何日文1，陈 裕1，胡永辉1，钟锦辉1，林 鸿1，钟卓玲1，殷 实1，张 桢1，林钟婷1，邓小敏1，彭 聪2，段晓冬2，郑丽兰1，张海明1

（1. 广州市动物疫病预防控制中心，广东广州 510440；2. 广州市农业局，广东广州 510405）

[目的]了解广州市活禽批发市场禽流感病毒的污染情况，为广州市制定有针对性的防控措施提供技术支持。[方法] 2015年2月—2016年1月，按照随机抽样原则，对广州市2个活禽批发市场进行调查，每月采集1次棉拭子样品（共3 090份），并对所采集的样品进行禽流感病毒荧光RT-PCR检测。[结果]在该期间内，2个活禽批发市场的样品禽流感总阳性率为52.50%（1 625/3 090）；禽流感病毒检出阳性率较高的月份是4月和9—12月，较低的是6—8月；水禽的禽流感感染风险是鸡的1.6倍，环境中存在禽流感病毒的风险是鸡的1.39倍；各月份中，1月、3月、11月和12月环境样品的禽流感病毒阳性率显著高于家禽样品（P＜0.01），而6月份家禽样品的禽流感病毒阳性率显著高于环境样品（P＜0.01）；来自广东省内（广州市除外）的活禽样品禽流感病毒阳性率最高，为49.31%，来自外省市的禽流感通用型阳性率最低，为31.43%（P＜0.01）。[结论]调查发现，广州市活禽批发市场的禽流感高发期为春夏及秋冬交替季节；活禽批发市场中的水禽和批发市场环境是禽流感病毒流行的关键危险因素。调查结果提示，今后要加强春夏和秋冬交替季节的禽流感防控工作，加强对批发市场水禽的禽流感防控和批发市场环境的清洗、消毒，以切实降低活禽批发市场的禽流感污染水平。

禽流感；活禽市场；活禽样品；环境样品；水禽；流行病学调查；

研究发现，活禽市场是禽流感病毒（Avian in fl uenza virus，AIV）的一个重要储存库[1]。在活禽市场，大量不同种属、不同产地来源、不同健康状况的活禽，以极高的密度聚集在一起，为AIV的基因重组和跨种间传播提供了有利条件[2]。因此，活禽市场被认为是禽流感病毒循环传播的关键风险点[3]，并且是人感染H5N1、H7N9等流感的高风险区域[4]。广州市所在的华南地区是“世界流感中心”之一[5]。该地居民有在活禽农贸市场购买现宰活禽的消费习惯，这进一步增加了人通过活禽市场感染禽流感的风险。目前已有较多研究对活禽农贸市场的禽流感病毒污染情况进行了调查[6-7]，但对于活禽批发市场的研究相对较少。而农贸市场的活禽绝大多数来自于活禽批发市场。为科学有效地开展禽流感防控，2015年2月—2016年1月选取广州市2个活禽批发市场开展了为期12个月的禽流感病原学监测，以期了解广州市活禽批发市场AIV的种属差异、季节流行差异、地区分布差异等信息，为进一步防控禽流感提供参考。

1 方法

1.1 选择对象

2015年2月—2016年1月，选取广州市的2个活禽批发市场。在每个活禽批发市场，每月采集样品1次。

1.2 抽样策略及样本量计算

按照随机抽样原则抽样。对于活禽批发市场内的禽类，按售卖的活禽种类进行分层（如鸡、水禽、其它禽类等3层）。采用两阶段随机抽样：第一阶段，通过简单随机或系统随机抽样的方式，选择所要进行采样调查的档口；第二阶段，对所选档口内的活禽进行简单随机抽样。

根据前期调查的活禽批发市场内不同活禽种类的档口数量，按照50%的档口预期流行率、40%的可接受绝对误差、95%的置信水平，确定需要采样的档口数量。然后，根据每个档口内活禽的存栏量，按照每个档口50%的个体预期流行率、90%的试验敏感性、95%的置信水平，确定每个档口需要采样的数量（每个档口存栏100～2 000只，计算得5份/档）。同时，在每个档口采集环境样品5份。每次采样的档口不固定。采样前，以系统随机方式进行随机抽样。对于环境样品，优先选择潮湿和脏的区域，如污水、饮水槽、地面、笼子、屠宰板、装屠宰活禽容器、垃圾箱等。

1.3 样品采集

对活禽样品，用棉拭子采集泄殖腔/咽喉双棉拭子；对环境样品，采用棉拭子涂抹方法。样品存放在一个装有10%甘油、双抗和PBS液的EP管中，对样品进行唯一性编号。

1.4 仪器与试剂

实时荧光定量PCR仪7500，购自美国应用生物有限公司；全自动核酸提取仪，购自美国Thermo公司；荧光实时定量禽流感通用（AIV）荧光定量RT-PCR检测试剂盒，购自中山达安基因股份有限公司；RNA提取试剂，购自美国应用生物有限公司。

1.5 病毒RNA提取及检测

按照美国应用生物有限公司AM1836-5 病毒核酸抽取试剂盒说明书方法和美国Thermo Scienti fi c KingFisher Flex全自动磁珠提取纯化系统的操作方法，提取病毒RNA；按照荧光实时定量禽流感通用（AIV）荧光定量RT-PCR检测试剂盒使用说明书，在实时荧光定量PCR仪7500仪器上进行检测。

1.6 数据分析和统计

采用SPSS 20统计软件和EXCEL软件，对调查结果进行数据统计和分析，对其中的发病风险比，采用Pearson卡方进行计算。

2 结果

2.1 不同月份的通用型禽流感阳性率比较

2015年2月—2016年1月，在广州市2个活禽批发市场共检测样品3 095份，检出阳性1 625份，全年平均检出阳性率为52.50%。在这12个月中，每个月都有阳性样品被检出。其中有5个月的阳性率大于平均阳性率，分别为4月和9—12月；1—5月的样品阳性率与全年平均阳性率差异不显著（P＞0.05），6—8月的样品阳性率显著低于全年平均阳性率，而9—12月的样品阳性率显著高于全年平均阳性率（P＜0.01）。各月阳性率见图1。

图1 2个活禽批发市场不同月份禽流感阳性率变化

2.2 不同种类样品的禽流感阳性率和发病风险比

对不同种类样品的禽流感检测发现，水禽棉拭子的阳性率最高，为66.67%，其它依次为环境棉拭子、鸡棉拭子和其它活禽棉拭子（图2）。以鸡棉拭子阳性率为参考，分别进行发病风险比分析，发现水禽的发病风险是鸡的1.6倍，环境中存在禽流感病毒的风险是鸡的1.39倍（P＜0.01），差异显著有统计学意义。风险比计算公式为：风险比（RR）=不同种类样品的阳性率/鸡棉拭子样品的阳性率。

2.3 不同月份、种类样品的禽流感阳性率比较

对2015年2月—2016年1月采集的活禽样品和环境样品进行通用型禽流感病毒检测，结果发现，1月、3月、11月和12月份的环境样品阳性率显著高于家禽样品（P＜0.01），而6月份家禽样品的阳性率显著高于环境样品（P＜0.01），其他月份的活禽样品和环境样品阳性率差异不明显（P＞0.05）。每月各样品阳性率变化见图3。

图2 不同种类样品禽流感阳性率比较

图3 不同月份和种类样品的通用型禽流感阳性率比较

2.4 活禽样品和环境样品的阳性率比较

比较广州市2个活禽批发市场活禽样品和环境样品的阳性率，结果发现环境样品的通用型禽流感核酸检测阳性率显著高于相应市场的活禽样品核酸阳性率（P＜0.05）。具体数据见表1。

表1 2个活禽批发市场活禽样品和环境样品的阳性率比较

2.5 不同来源活禽样品的通用型禽流感阳性率和发病风险比

对2个活禽批发市场不同来源地区的活禽样品阳性率进行比较分析，结果发现广州市以外的广东省内地区阳性率最高，为49.31%，广东省外地区的最低，为31.43%。以广州市活禽样品阳性率为参考，计算发现广州市的活禽发病风险是外省市的1.52倍，具有统计学意义（表2）。

表2 不同来源地区的活禽样品禽流感病毒阳性率和发病风险比

3 讨论

本研究对广州市2个活禽批发市场2015年2月—2016年1月的禽流感病毒污染情况进行了分析，结果发现每个月份都有阳性样品被检出，其中4月和9—12月的检出阳性率均高于全年平均值。根据采样检测结果发现，1—5月份的检出阳性率与全年平均值差异不显著，6—8月份的阳性率显著低于平均值，而9—12月份的阳性率显著高于平均值。分析其原因可能是：广州市地处亚热带沿海地区，全年平均气温为21.9 ℃，此湿热环境极适合禽流感病毒的生长繁殖，因此全年都检测出阳性样品；6—8月份是广州市的最热时期，高温环境不利于病毒的繁殖，因此禽流感阳性率较低；而4月份和9—12月份分别是春夏和秋冬交替时期，气温度较低，因此禽流感检出阳性率明显高于其它月份。这与曹蓝等[8]的监测结果基本一致，也与人感染禽流感的高发季节相一致[9]。

以鸡棉拭子的阳性率为参考，进行其他种类样品的发病风险对比分析发现，水禽的发病风险是鸡的1.6倍，这与Olsen等[10]和Swayne等[11]的研究结论一致；环境中存在病毒的风险是鸡的1.39倍，且差异显著，具有统计学意义，与Wang等[12]和颜玉炳等[13]的研究结果基本一致，说明水禽和环境是活禽批发市场禽流感防控的重要节点。因此，建议在活禽批发市场，加强对水禽和环境的卫生监督和消毒管理，或是在市场内划出独立的区域销售水禽。

不同来源地区的活禽样品阳性率比较结果显示，广州市与广东省内地区（广州市除外）的样品阳性率无统计学差异，而来自广东省外地区的阳性率明显低于广州市及广东省内地区。基于此，可以认为目前对于广州市而言，禽流感的输入风险主要来自本地而不是外地。该研究仅对2个批发市场12个月的数据进行了分析，尚未开展H5、H7等亚型高致病性禽流感病毒的检测和分析，下一步有必要对此开展相应的深入研究，以切实了解本地区的高致病性禽流感输入风险。

[1]SHORTRIDGE K F. Pandemic influenza：A zoonosis [J]. Semin Respir Infect，1992（7）：11-25.

[2]LIU M，HE S Q，WALKER D，et al. The influenza virus gene pool in a poultry market in south central China [J]. Virology，2003，305（2）：267-275.

[3] BOB B，郭福生，彭聪，等. 关于升级改造活禽市场降低禽流感循环传播风险的初步研究[J]. 中国动物检疫，2013，30（6）：51-55.

[4]KUNG N Y，MORRIS R S，PERKINS N R，et al. Risk for infection with highly pathogenic in fl uenza A virus（H5N1）in chickens，Hong Kong，2002[J]. Emerg Infect Dis，2007，13（3）：412-418.

[5]SHORTRIDGE K F. Is China an in fl uenza epicenter[J]. Chin Med J（Engl），1997，110：637-641.

[6]段晓冬，沈丹，张海明，等. 2013 年广州市活禽农贸市场禽流感流行病学调查[J]. 中国动物检疫，2014，31（11）：33-36.

[7]张烨，李晓丹，邹淑梅，等. 2009-2013年我国活禽市场环境样本中禽流感病毒的检测[J].病毒学报，2015，31（6）：615-619.

[8]曹蓝，陈艺韵，鲁恩洁，等. 广州市2015年禽类市场流感流行病学监测[J]. 中国动物检疫，2016，33（8）：8-12.

[9]World Health Organization. Epidemiology of WHO-con fi rmed human cases of avian in fl uenza A（H5N1）infection [J]. Weekly Epidemiological Record，2006，26（81）：249-260.

[10] OLSEN B，MUNSTER V J，WALLENSTEN A，et al. Global patterns of in fl uenza A virus in wild birds. [J]. Science，2006，312（5772）：384-388.

[11]SWAYNE D E，HALVORSON D A. Influenza[M]//SAIF Y M，BARNES H J，GLISSON J R，et al. In Diseases of poultry. 11th ed. Ames，IA：Iowa State Press，2003：135-160.

[12]WANG X X，LIU S L，MAO H Y，et al. Surveillance of avian H7N9 virus in various environments of Zhejiang province，China before and after live poultry markets were closed in 2013–2014[J]. PLoS One，2015，10（8）：e0135718.

[13]颜玉炳，刘红莲，蒋丽娜，等. 禽类外环境H7N9禽流感病毒检出率及其影响因素[J]. 中国热带医学，2016，16（1）：49-59.

（责任编辑：朱迪国）

Epidemiological Survey on Avian In fl uenza in Live Poultry Wholesale Markets of Guangzhou City

Zhang Haibing1，Yang Suijuan1，Peng Nanxiu1，Shen Dan1，Xue Hong1，He Riwen1，Chen Yu1，Hu Yonghui1，Zhong Jinhiu1，Lin Hong1，Zhong Zhuoling1，Yin Shi1，Zhang Zhen1，Lin Zhongting1，Deng Xiaomin1，Peng Cong2，Duan Xiaodong2，Zheng Lilan1，Zhang Haiming1
（1. Guangzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Guangzhou，Guangdong 510440；2. Guangzhou Agriculture Bureau，Guangzhou，Guangdong 510405）

[Objective] For fi guring out the infection status of avian in fl uenza virus（AIV）in live poultry wholesale markets in Guangzhou city，and providing technical supports for AI prevention and control．[Methods] An investigation towards 2 poultry wholesale markets was carried out from February 2015 to January 2016. Cotton swabs were sampled once a month，then altogether 3 090 collected samples were tested by real-time RT-PCR for AIV. [Results] The total positive rate of the two markets was 52.50%（1 625/3 090）in the whole period. Serious AIV infection was found in months of April and September to December，showing high positive rates，while the rates were lower in June to August. Compared with chicken swabs，the risk of waterfowl swabs carrying AIV was 1.6 times higher，and that of environmental swabs was 1.39 times higher. In addition，AIV positive rates in environmental samples were signi fi cantly higher than that in poultry samples（P＜ 0.01）in January，March，November and December，whereas June justthe opposite. The highest AIV positive rate of 49.31% were tested from avian samples of Guangdong province（except Guangzhou city）among the various origin areas，and the lowest rate of 31.43% for universal AIV was found from other provinces（P＜ 0.01）.[Conclusion]The seasons of high incidence of AI were periods from spring to summer and autumn to winter. Waterfowls and the environment in poultry wholesale markets were the key risk factors associated with AI prevalence. The results indicated that prevention and control of AI during high-occurrence seasons should be strengthened，so did the waterfowls，and the market environment should also be cleaned and disinfected frequently，so as to reduce the pollution levels effectively.

avian influenza；live bird markets；live poultry samples；environmental samples；waterfowls；epidemiological investigation

S851.38

B

1005-944X（2017）03-0001-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.001

广东省农业厅H7N9流感联合攻关项目（粤农函〔2014〕1046号）；广东省省级科技计划项目“H7N9亚型禽流感诊断方法和综合防控技术研究”（2013B020224004）

并列第一作者：张海冰、杨穗娟、彭南秀、沈 丹

彭 聪、段晓冬、郑丽兰、张海明