丹参酮ⅡA对脑出血大鼠脑组织HIF-1α和VEGF表达的影响

赵红领， 李 磊， 苗 成， 杨 慧， 常文广

丹参酮ⅡA对脑出血大鼠脑组织HIF-1α和VEGF表达的影响

赵红领， 李 磊， 苗 成， 杨 慧， 常文广

目的 探讨丹参酮ⅡA对脑出血大鼠的干预作用以及对HIF-1α和VEGF表达的影响。方法 将大鼠随机分为假手术组、脑出血组、丹参酮ⅡA干预I组和II组，除假手术组外，其余大鼠均通过注射胶原酶的方法建立脑出血模型，丹参酮IIA干预Ⅰ组和Ⅱ组分别腹腔注射丹参酮IIA30 mg/kg，每天一次和30 mg/kg，每天两次，共给药15 d。给药完成后，对各组大鼠进行神经功能缺损评分，称重法计算脑组织的含水量，免疫组化法与实时荧光定量PCR检测脑组织中HIF-1α和VEGF的蛋白表达与mRNA表达。结果 与脑出血组相比，丹参酮IIA干预组大鼠的神经功能缺损评分显著升高，脑组织含水量显著下降，脑组织中HIF-1α和VEGF的蛋白表达与mRNA表达显著升高。结论 丹参酮IIA对脑出血大鼠脑组织具有保护作用，其作用机制可能与HIF-1α和VEGF因子的表达有关。

脑出血； 丹参酮IIA； HIF-1α； VEGF

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神经系统常见疾病，临床上常见，占脑卒中的比例约为20%～40%，发病率和致残率较高，我国脑出血的发病率约为17.1%～55.4%[1]。随着人口结构的老龄化加剧以及饮食结构的变化，脑出血的发病率逐渐上升，发病后约有75%的患者致残，治疗期与恢复期的高额费用对患者家庭是一种沉重的负担。

丹参在国内广泛用于治疗心脑血管疾病，丹参酮IIA(Tanshinone ⅡA)是丹参的主要活性单体，具有抗氧化、清除自由基、抗动脉粥样硬化等多种药理活性[2,3]。多项研究表明丹参酮IIA对脑缺血再灌注损伤中，通过抑制线粒体裂解，调节bcl-2/bax的表达，增加谷胱甘肽过氧化物酶的活性，清除自由基，抑制细胞凋亡，从而发挥神经保护的作用[4,5]。此外，30 mg/kg丹参酮ⅡA能够减少脑梗死大鼠的脑梗死体积，具有很好的脑保护作用[6]。本实验拟通过注射胶原酶的方法建立脑出血大鼠模型，观察丹参酮ⅡA对脑出血大鼠脑组织的保护作用，并讨论可能的初步机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，SPF级，8～12周龄，体重200～240 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK(京)2012-0012；饲养条件：22 ℃～26 ℃，湿度50%～60%，分笼，标准饲料和纯净水喂养，进行适应性饲养1 w。

1.2 实验试剂 丹参酮IIA购自上海芃硕生物科技有限公司(丹参酮ⅡA混悬于1%的二甲基亚砜的PBS平衡盐溶液制成混悬液)；胶原酶购自Sigma公司；HIF-1α和VEGF抗体购自Abcam公司；HIF-1α、VEGF和GADPH引物由上海英骏生物工程公司提供；其他试剂为国产试剂。

1.3 实验分组与脑出血大鼠模型的建立 将40只大鼠随机分为4组：假手术组(Sham)、脑出血组(ICH)、丹参酮IIA干预I组(Tan-Ⅰ)和II组(Tan-Ⅱ)；除假手术组外，其余各组小鼠参考Rosenberg等[7]方法，建模前12 h禁食禁水，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，俯卧固定大鼠，沿头颅正中切开皮肤，暴露前囱，于右侧尾壳核体表前囱垂直3 mm后，侧开1 mm处，用颅骨钻开此处，用微量进样器将2 μl胶原酶匀速注入，进针深度为5.5 mm，留针5 min，取出微量进样器，缝合切口，术后腹腔注射青霉素80万单位预防感染。模型成功判定标准：建模后可见明显肢体瘫痪，沿针孔冠状切面可见脑组织中有血肿形成。建模后，丹参酮IIA干预Ⅰ组大鼠腹腔注射30 mg/kg，每天一次；Ⅱ组大鼠腹腔注射30 mg/kg，每天两次，共给药15 d。

1.4 神经功能缺损评分 各组大鼠于造模成功后3 d、6 d、9 d、12 d和15 d，依据Garcia等[8]方法进行神经功能评分，分值范围3～18分，分值越低，神经功能障碍越严重。评分标准：自发活动(0～3分);四肢对称运动(0～3分);前肢对称外展(0～3分);爬铁笼壁(1～3分);躯干对钝棒触及的反应(1～3分);触须对钝棒触及的反应(1～3分)。

1.5 标本采集 在给药完成后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速断头，打开头颅，取出脑部，分离出血肿组织。

1.6 脑组织含水量 深度麻醉大鼠，断头取脑，沿中线切开，精密称量湿重(wwt)，放置于80 ℃烘箱烘烤48 h，直至恒重，称量干重(dw)，计算脑组织含水量(%)=(wwt-dw)/wwt×100%。

1.7 免疫组化法检测HIF-1α和VEGF蛋白含量 将脑组织制作成石蜡切片，二甲苯脱蜡，依次浸入梯度酒精(100%、95%、85%、75%)各5 min，加入0.01 mol枸橼酸盐缓冲液，微波修复20 min，PBS洗涤，加入封闭液室温孵育10 min，PBS洗涤，加入相应一抗，4 ℃孵育过夜，随后加入对应二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，再次用梯度酒精脱水(75%、85%、95%、100%)，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.8 实时荧光定量PCR 将脑血肿组织匀浆后加入1 ml Trizol，室温放置5 min，12000 rpm 4 ℃离心15 min，提取总RNA，以逆转录酶催化合成cDNA，以cDNA为模板在聚合酶催化下进行PCR反应， HIF-1α引物：上游5’-GTCGGACAGCCTCACCAAACAGAGC-3’，下游5’-GTTAACTTGATCCAAAGCTCTGAG-3’；VEGF引物：上游5’-CAGCCCCAGCTACCACCTC -3’，下游5’-TCTTCCTCCTCCCCCTCCTC-3’;GADPH引物：上游5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’；93 ℃ 42 s， 60 ℃ 40 s，73 ℃ 55 s，共32个循环，实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比，目标基因的相对定量用2-△△CT计算。

2 结 果

2.1 神经功能缺损评分 进行脑出血造模后，大鼠出现了神经功能缺损的症状，脑出血组大鼠在6 d时达到峰值，丹参酮ⅡA干预组在相同时间的神经功能缺损症状轻于脑出血组，差异具有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

2.2 脑组织含水量的测定 脑出血组大鼠同侧脑组织的含水量(83.35%±0.72%)显著高于假手术组(72.23%±0.64%);丹参酮ⅡA干预组Ⅰ组(79.18%±0.62%)和Ⅱ组(75.58%±0.43%)的脑组织含水量均显著低于脑出血组(P<0.05)，差异具有统计学意义。

2.3 HIF-1α和VEGF蛋白表达的变化 脑出血组大鼠脑组织的HIF-1α和VEGF的免疫阳性细胞数明显高于假手术组(P<0.05);丹参酮ⅡA干预组的HIF-1α和VEGF的免疫阳性细胞数显著高于脑出血组(P<0.05)，差异具有统计学意义。

2.4 HIF-1α和VEGF mRNA表达水平的变化 脑出血组大鼠脑血肿组织的HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平明显高于假手术组(P<0.05);丹参酮ⅡA干预组的HIF-1α和VEGF的mRNA表达水平显著高于脑出血组(P<0.05)，差异具有统计学意义。

表1 各组大鼠神经功能缺损评分(±s)

与假手术组组对比*P<0.05；与ICH组相比#P<0.05

3 讨 论

脑出血是常见的非外伤性致死性疾病，目前仍缺乏有效可靠的治疗方法。脑出血后导致急性脑水肿以及血肿周围脑组织缺血缺氧，继发造成神经组织损伤。主要是由于血肿周围组织血流量减少、乳酸堆积、血肿活性物质释放等引起血肿周围脑组织缺血缺氧、神经元凋亡，从而出现神经组织损伤。脑出血后脑含水量的增加，推测是由于脑细胞内钠钾泵功能的失调，从而引起脑组织出现水分的异常增加。丹参酮ⅡA能够降低脑出血后脑含水量，可能与其抑制炎性细胞和炎性因子的渗入，而产生的毒性作用，形成细胞毒性水肿。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α，Hypoxia inducible factor-1α)是连接在促红细胞生成素基因的低氧反应的一种核转录因子[9，10]，在正常状态下组织几乎不表达，但在低氧状态下，HIF-1α的表达增高，并随缺氧程度与缺氧时间相关[11]。国内报道指出HIF-1α的阳性表达率随脑出血时间延长而增加[12]，研究发现缺氧诱导生成的HIF-1α具有保护脑组织损害的作用[13]。我们的实验结果显示，脑出血大鼠脑组织中HIF-1α显著增加，使用丹参酮ⅡA干预后，血肿周围脑组织中HIF-1α的表达明显高于脑出血组，提示HIF-1α表达的上调对脑出血后脑组织的损伤具有保护作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是HIF-1α的目的基因，作为血管内皮细胞分裂原，能够特异性诱导内皮细胞的有丝分裂，促进血管内皮细胞增殖，修复血管内膜，维持内膜完整性。在血管形成之前，VEGF对神经系统具有直接的保护作用[14]。报道指出，VEGF具有一定的促神经再生作用，在脑缺血灶周脑组织中VEGF的表达显著上升，微血管密度显著增加，有效改善缺血半暗带的血块[15,16]。我们的实验结果显示，使用丹参酮ⅡA干预后，血肿周围脑组织的VEGF表达显著高于脑出血组，推测丹参酮ⅡA通过调节VEGF的表达，改善血管内皮细胞功能，促进血管新生，提高微血管的抗损能力，从而发挥保护脑出血损伤的脑组织。

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Effects of Tanshinone ⅡA on HIF-1α and VEGF expression in brain tissue of intracerebral hemorrhage rats

ZHAOHongling,LILei,MIAOCheng,etal.

(DepartmentofNeurology,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,China)

Objective To investigate the improvement of Tanshinone ⅡA on intracerebral hemorrhage (ICH) the effects on HIF-1α and VEGF expression.Methods Rats were randomly divided into 4 groups:sham,ICH,ICH treated with Tanshinone ⅡA once a day and ICH treated with Tanshinone IIA twice a day.In addition to sham rats,the rats were injected with collagenase to established ICH model,and then were injected with 30 mg/kg of Tanshinone ⅡA intraperitoneally once or twice a day.At the end of 15-day experimental period,rats neural function of each group was scored and the water content in brain were calculated accordingly.The expression of HIF-1α and VEGF were determined by western blot and quantitative PCR,respectively.Results Compared with ICH group,the neural function was significantly improved and the water content in brain was decreased after Tanshinone ⅡA administration.Moreover,Tanshinone IIA treatment resulted in a markedly increase of HIF-1α and VEGF expression when compared with ICH rats.Conclusion Tanshinone ⅡA treatment can improve the neural function in brain tissue of ICH rats,which may be related with the regulation of HIF-1α and VEGF expression.

Intracerebral hemorrhage; Tanshinone ⅡA; HIF-1α; VEGF

1003-2754(2017)02-0130-03

2016-10-26；

2016-11-29

(新乡市中心医院神经内科，河南 新乡 453000)

赵红领，E-mail:honglingzhao69@163.com

R743.34

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