血清miRNA检测对直肠癌患者新辅助放化疗效果的预测价值

鞠芳，卢琳，李绪彤，赵清叶，李娜，袁海成

(青岛市中心医院，山东青岛266042)

血清miRNA检测对直肠癌患者新辅助放化疗效果的预测价值

鞠芳，卢琳，李绪彤，赵清叶，李娜，袁海成

(青岛市中心医院，山东青岛266042)

目的 探讨血清微小RNA(miRNA)has-let-7a、-7e及-7g检测对直肠癌患者新辅助放化疗效果的预测价值。方法 选择中低位直肠癌患者43例，均采用奥沙利铂联合卡培他滨方案(XELOX)化疗及放疗5周。治疗后根据Mandard肿瘤消退分级标准分为消退良好组18例，无明显消退组25例。治疗前采用实时定量聚合酶链式反应技术检测血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表达；用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g对直肠癌放化疗后肿瘤病理消退程度的预测价值，对比三者ROC曲线下面积(AUC)。结果 治疗前消退良好组血清miRNA has-let-7e相对表达量低于无明显消退组(P<0.05)；两组血清hsa-let-7a和has-let-7e表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)。miRNA has-let-7e预测新辅助放化疗效果的AUC大于has-let-7a、has-let-7g的AUC(P均<0.05)。结论 血清miRNA has-let-7e可作为预测直肠癌新辅助放化疗疗效的血清标志物。

直肠肿瘤；微小RNA；新辅助化疗；放射治疗

结直肠癌是世界范围内导致肿瘤相关死亡的重要原因之一，其中约30%为直肠癌[1]。多数直肠癌患者就诊时已处于中晚期。近年来，新辅助放化疗联合手术治疗已经成为中晚期直肠癌患者的标准治疗手段。但由于患者个体差异较大，新辅助放化疗疗效也存在差异[2]。通过对放化疗疗效进行预测，对疗效较差患者尽早给予手术治疗，可避免无效治疗[3]。目前临床、代谢指标及影像学手段对疗效的预测并不理想[4～6]。微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，能够通过剪切或翻译抑制对靶基因进行转录后水平的负调控[7,8]。目前探讨miRNAs是否可作为直肠癌新辅助化疗疗效预测标志物的研究较少[9～11]。本研究对miRNA has-let-7a、-7e及-7g在直肠癌新辅助化疗疗效预测中的价值进行探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2012年1月～2013年3月本院收治的中低位直肠癌患者43例，均经肠镜活检确诊，经盆腔CT或MRI检查确定肿瘤分期，经辅助检查排除肝或肺等远端器官转移，可耐受放化疗。其中男32例、女11例，年龄32～78岁，TNM分期Ⅱ期4例、Ⅲ期39例，Karnofsky评分>60分。患者均签署知情同意书，并接受随访。本研究经医院伦理协会批准。

1.2 治疗方法 患者均接受奥沙利铂联合卡培他滨方案(XELOX)化疗及放疗。放疗方法：直线加速器X线照射靶区(直肠原发灶和淋巴引流区域)，用等中心三野照射法，后野∶左侧野∶右侧野=2∶1∶1，放射总剂量为50 Gy，2.0 Gy/次，1次/d，每周照射5 d。化疗方法：奥沙利铂每次50 mg/m2，加入50 g/L葡萄糖注射液250 mL静滴2 h，1次/周；卡培他滨每次800 mg/m2口服，2次/d，每周5 d。放化疗同步进行，均连续治疗5周。在新辅助放化疗期间定期检查患者血常规和肝肾功能，同时对患者进行积极对症支持治疗和营养治疗。

1.3 疗效评价标准 治疗结束后用肿瘤病理消退程度来评价新辅助放化疗治疗效果。术后标本送病理科进行病理分析，采用Mandard肿瘤消退分级标准(TRG)对直肠癌病理消退情况进行评价，TRG1级：肿瘤完全消退，完全无残留癌细胞；TRG2级：肿瘤消退良好，少量残留癌细胞；TRG3级：肿瘤中度消退，肿瘤组织中伴明显纤维化，纤维化占26%～50%；TRG4级：肿瘤轻度消退，肿瘤组织中伴明显纤维化，但不超过肿瘤的25%；TRG5级：肿瘤无消退，肿瘤细胞无变化，无纤维组织。TRG1、2级视为肿瘤病理消退良好，TRG3、4、5级视为肿瘤无明显消退[12]。

1.4 血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g表达检测 采用实时定量聚合酶链式反应技术(qRT-PCR)。治疗前采集患者清晨空腹静脉血，置于含枸橼酸钠的抗凝管中，经低温、超速和离心获得血清，存放于-80 ℃冰箱备用。用miRNA提取试剂盒提取RNA，并检测RNA质量(A260/A280 为1.8～2.1)。通过Taqman miRNA反转录试剂盒反转录RNA获得cDNA，参照qRT-PCR试剂盒说明书，以cDNA为反应模板，依次加入上下游引物、2×SYBR green PCR Master Mix以及无RNase双蒸水，配置成反应体系。在ABI公司7300 PCR仪中进行反应，反应条件：预变性95 ℃ 10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共扩增40个循环，每个样本重复2次。采用2-ΔΔct法计算miRNA相对表达量。

2 结果

2.1 不同消退程度患者治疗前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g表达比较 43例患者经治疗后TRG1级9例、2级9例、3级17例、4级6例、5级2例；消退良好组18例，无明显消退组25例。患者治疗前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相对表达量比较见表1。

表1 两组治疗前血清miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g相对表达量比较

注：与无明显消退组比较，*P<0.05。

2.2 miRNA hsa-let-7a、-7e和-7g对放化疗疗效的预测价值 绘制ROC曲线，见图1。miRNA has-let-7e的AUC(0.760)大于miRNA has-let-7a(0.551)、miRNA has-let-7g(0.560)，比较差异有统计学意义(P均<0.05)，miRNA has-let-7a与miRNA has-let-7g的AUC比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

图1 miRNA has-let-7a、-7e及-7g预测直肠癌

3 讨论

新辅助治疗可以视为肿瘤患者肿瘤细胞的减量治疗，包括术前化疗或者术前化疗与放疗相结合，其能够减小患者的肿瘤负荷，提高肿瘤患者手术完全切除率。XELOX已经成为直肠癌化疗一线治疗方案的首选，是进展期直肠癌患者一种新的辅助治疗手段。与术后放化疗比较发现，新辅助放化疗可以减少放化疗毒副反应、改进直肠癌局部控制、增加保肛率并且延长患者的无进展生存时间。但由于患者个体差异较大，新辅助放化疗的治疗效果差异也比较大。个体的遗传因素是导致个体治疗敏感性的重要因素[13]。研究表明，导致肿瘤发生的分子基础为肿瘤信号通路异常。通过检测分析患者肿瘤信号通路基因的表达水平，可以获得肿瘤放化疗耐受或敏感的分子标志物，利用这些分子标志物可以预测新辅助放化疗的治疗敏感性，加强患者的个体化治疗[14]。同时研究也表明，肿瘤患者血浆中游离的DNA、RNA及某些基因突变与肿瘤组织保持着高度的一致性，因此外周血肿瘤标志物的筛选是目前肿瘤领域的研究热点之一。基于肿瘤分子标志物可以优化患者的个体治疗，也是目前肿瘤治疗的趋势[15]。miRNA是高度保守的内源性非编码单链RNA。miRNA非常稳定，在剧烈条件下，如高温、骤冷、强酸、强碱等，都很难发生降解，同时期可以抵御由于RNA酶导致的降解。因此miRNA作为新的分子标志物将为肿瘤患者的早期诊疗提供全新的手段。

目前仅有少量研究探讨循环miRNA在预测结直肠癌新辅助放化疗疗效的预测作用。miRNA has-let-7a、-7e、-7g可能为预测直肠癌新辅助放化疗效果的因子[16,17]，但研究样本量有限。在本研究中，我们纳入43例直肠癌患者，检测新辅助放化疗前血清miRNA has-let-7a、-7e及-7g，结果发现，miRNA has-let-7e表达水平与疗效相关，miRNA has-let-7e高表达的直肠癌患者，新辅助放化疗效果差；ROC曲线也显示其对疗效预测的准确度较高。未来需要更多前瞻性研究就miRNA has-let-7e对直肠癌新辅助放化疗的预测作用进行验证。

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袁海成(E-mail:yuanhaicheng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.030

R735.37

B

1002-266X(2017)05-0089-03

2016-11-14)