胰高血糖素对胰岛β细胞胰岛素分泌的调节作用及机制

石艳秋，李军，李思源，张震,孙侃，王彦文

(1石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000；2石河子大学医学院；3郑州市第一人民医院;4济南市协和医院)

胰高血糖素对胰岛β细胞胰岛素分泌的调节作用及机制

石艳秋1，李军1，李思源2，张震3,孙侃1，王彦文4

(1石河子大学医学院第一附属医院，新疆石河子832000；2石河子大学医学院；3郑州市第一人民医院;4济南市协和医院)

目的 观察胰高血糖素对胰岛β细胞(MIN6细胞株)胰岛素(INS)分泌的调节作用，并探讨其作用机制。方法 将培养好的MIN6细胞均转染对环磷酸腺苷(cAMP)敏感的荧光生物传感器DNA质粒ICUE3。转染48 h将细胞随机分为三部分，分别在无糖、低糖(葡萄糖2.8 mmol/L)、高糖(葡萄糖16.7 mmol/L)环境下培养400～600 s，之后各环境下的细胞随机分为四组：0、100、500、1 000 ng/L组，分别用不同浓度(0、100、500、1 000 ng/L)胰高血糖素处理350～600 s。采用荧光共振能量转移技术检测MIN6细胞中cAMP水平，ELISA法检测细胞INS分泌量。结果 在无糖环境下，MIN6细胞内cAMP水平及INS分泌量1 000 ng/L组>500 ng/L组>100 ng/L组，各组两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。在低糖、高糖环境下，MIN6细胞内cAMP水平及INS分泌量1 000 ng/L组>500 ng/L组>100 ng/L组>0 ng/L组，各组两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)；且高糖环境下以上差异更明显。结论 胰高血糖素可能以浓度梯度的形式通过升高胰岛β细胞内cAMP水平来促进INS分泌，且该作用有一定的葡萄糖依赖性。

胰高血糖素；胰岛素；胰岛β细胞；环磷酸腺苷

1、2型糖尿病发病均与胰岛素(INS)分泌密切相关[1～3]，INS分泌及其功能成为研究热点[4]。INS分泌受多种因素的控制，除各种供能物质外，多种激素和神经递质可通过改变某些第二信使浓度等途径调节INS分泌[5]。胰高血糖素是由胰岛α细胞分泌的多肽类激素。有研究表明，胰高血糖素可使体外培养猪胰岛细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)水平升高，激活蛋白激酶，继而促进INS的释放[6]。2012年1月～2015年1月，本研究体外培养小鼠胰岛β细胞MIN6，并给予不同浓度的葡萄糖及胰高血糖素干预，探讨胰高血糖素对INS分泌的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 小鼠来源的胰岛β细胞瘤株MIN6细胞(由湘雅二院馈赠)；对cAMP敏感的荧光生物传感器DNA质粒ICUE3(由美国霍普金斯大学实验室构建并馈赠)，经提取扩增后储存备用；高糖DMEM培养基、无糖DMEM培养基(GIBCO)，L-谷氨酰胺、胰高血糖素(sigma)，胰高血糖素受体抗体(GLR ab75240，Abcam)，小鼠INS ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)，cAMP-ELISA试剂盒(Biovision)，质粒大提试剂盒(德国，QIAGEN)等。Krebs：119 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3，调定pH值7.40，定容1 000 mL，根据预实验分别加入0、2.8、16.7 mmol葡萄糖制备无糖、低糖、高糖环境。

1.2 MIN6细胞培养、转染及干预 MIN6细胞用含4.5 g/L葡萄糖、2%青链霉素、1% L-谷氨酰胺及1‰ β-巯基乙醇的DMEM培养基，于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养，传至4～15代。将MIN6细胞以4×105/孔于6孔培养板中培养，在对数生长期细胞用于实验，均转染ICUE3质粒48 h。将细胞随机分为三部分，分别在无糖、低糖、高糖环境下培养400～600 s，之后各环境下的细胞随机分为四组：0、100、500、1 000 ng/L组，分别用不同浓度(0、100、500、1 000 ng/L)胰高血糖素处理350～600 s。

1.3 MIN6细胞中cAMP水平检测 采用荧光共振能量转移(FRET)技术。取转染后MIN6细胞置于激光共聚焦显微镜下，定位单个细胞视野。处理后的细胞分别追加毛喉素(FSK)处理200 s左右。细胞处理前100 s及处理过程中用激光共聚焦显微镜每10秒采集荧光图像1次，记录波长485、535 nm处接收到的荧光强度；以无糖环境未经胰高血糖素处理的细胞作对照，将FRET发射比值青色荧光蛋白(CFP)/黄色荧光蛋白(YFP)的上升率作为cAMP水平上升率。CFP激发波长为420～440 nm，发射波长为485 nm；YFP激发波长470～490 nm，发射波长为535 nm。

1.4 MIN6细胞INS分泌量检测 取处理后的各组细胞，收集细胞上清液，用ELISA法检测上清液中INS水平。

2 结果

2.1 不同浓度胰高血糖素在无糖、低糖、高糖环境下对MIN6细胞中cAMP水平的影响 在无糖环境下，cAMP水平1 000 ng/L组>500 ng/L组>100 ng/L组，各组两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。在低糖、高糖环境下，cAMP水平1 000 ng/L组>500 ng/L组>100 ng/L组>0 ng/L组，各组两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)；且高糖环境下以上差异更明显。见表1。

表1 不同浓度胰高血糖素在无糖、低糖、高糖环境下对MIN6细胞中cAMP水平的影响

2.2 不同浓度胰高血糖素在无糖、低糖、高糖环境下对MIN6细胞INS分泌量的影响 在无糖环境下，INS分泌量1 000 ng/L组>500 ng/L组>100 ng/L组，各组两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)。在低糖、高糖环境下，INS分泌量1 000 ng/L组>500 ng/L组>100 ng/L组>0 ng/L组，各组两两比较差异有统计学意义(P均<0.05)；且高糖环境下以上差异更明显。见表2。

表2 不同浓度胰高血糖素在无糖、低糖、高糖环境下对MIN6细胞INS分泌量的影响

3 讨论

研究表明，胰高血糖素受体(GCGR)是由7个跨膜G蛋白偶联形成，胰高血糖素与INS之间的比例是影响血糖浓度的一个重要因素[7]。胰高血糖素对β细胞INS分泌的调节作用可能通过先与细胞膜上的GCGR相结合，引起腺苷酸环化酶活化，从而使ATP环化为cAMP，再通过cAMP-PKA第二信使信号途径实现的[8，9]，此作用中第二信使cAMP可能是胰高血糖素参与调控INS分泌的桥梁[10]，在INS分泌机制中扮演重要角色。

本研究预实验模拟人体低糖、高糖环境，确定葡萄糖的终浓度。FSK是一种疏水性腺苷酸环化酶(AC)激活剂，可以直接刺激升高哺乳动物细胞内AC(除去IX型所有亚型)的活性，使细胞内cAMP水平升高，增强荧光接收强度。ICUE3质粒可表达一种生物合成的对cAMP敏感的荧光生物传感器。当胞内cAMP水平增加时，除细胞外观上荧光叠加图像的颜色变化以外，CFP/YFP的FRET发射比值增加，可作为细胞内cAMP水平增加的指标。据文献[11，12]报道，低浓度少量的胰高血糖素和高浓度大量胰高血糖素对β细胞的作用机制稍有不同。少量的胰高血糖素通过使细胞去极化致电压依赖性钙通道开放，胞内游离钙离子浓度升高，直接引起INS释放；当大量胰高血糖素刺激时，cAMP水平升高，激活PKA等途径以促进INS分泌。本研究中MIN6细胞内cAMP水平检测结果显示，单纯葡萄糖环境下高糖较无糖、低糖升高；无糖环境下1 000、500 ng/L胰高血糖素高于0、100 ng/L胰高血糖素，1 000 ng/L与500 ng/L差异不明显；低糖、高糖环境下1 000 ng/L胰高血糖素高于0、100 ng/L胰高血糖素，且高糖环境时，1 000 ng/L胰高血糖素高于500 ng/L胰高血糖素。这表示胰高血糖素可能以浓度梯度增加细胞内cAMP的水平，也显示了对葡萄糖的依赖性。同时观察不同浓度胰高血糖素对INS分泌量的影响，无糖环境下，经胰高血糖素处理后INS分泌量均升高，且随着胰高血糖素浓度升高，INS分泌量依次升高。

综上所述，本研究在活细胞中测得随着胰高血糖素浓度的增加胰岛β细胞内cAMP水平增加，INS分泌增加。这说明胰高血糖素可能通过增加MIN6细胞内cAMP水平促进INS分泌，且这一作用具有一定的葡萄糖依赖性。

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Regulatory effect of glucagon on insulin secretion of pancreatic β cells

SHIYanqiu1,LIJun,LISiyuan,ZHANGZhen,SUNKan,WANGYanwen

(1TheFirstAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

Objective To explore the regulation effect and mechanism of glucagon on insulin secretion of the pancreatic β cell-MIN6 cells. Methods The cultured MIN6 cells were transfected with ICUE3, a fluorescent biosensor DNA sensitive to cyclic adenosine monophosphate (cAMP), and then were randomly divided into three groups, respectively, which were cultivated for 400-600 s under the glucose-free, low-glucose (2.8 mmol/L glucose) and high-glucose (16.7 mmol/L glucose) conditions. Then the cells in each group were randomly divided into four groups: 0, 100, 500, and 1 000 ng/L groups which were treated with 0, 100, 500, and 1 000 ng/L glucagon for 350-600 s. Using fluorescence resonance energy transfer technology (FRET) to detect the cAMP levels in MIN6 cells, and the Ins secretion was measured by enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA).Results Under the glucose-free condition, the levels of cAMP and Ins secretion in MIN6 cells of the 1 000 ng/L group were significantly higher than those in the 500 ng/L group, and significant difference was found between every two groups (allP<0.05). Under the low-glucose and high-glucose conditions, the levels of cAMP and Ins secretion in MIN6 cells: 1 000 ng/L group > 500 ng/L group >100 ng/L group >0 ng/L group, significant difference was found between every two groups (allP<0.05). And under the high glucose environment, the difference was more significant.Conclusion Glucagon may stimulate insulin secretion by increasing cAMP levels in the way of concentration gradient within the islet β cell line-MIN6 cells, and this trend is glucose-dependent.

glucagon; insulin; pancreatic β cells; cyclic adenosine monophosphate

兵团中青年科技创新领军人才专项(2015BC001)；兵团科技援疆项目(2014AB049)；兵团博士资金专项(2012BB019)。

石艳秋(1989-)，女，在读硕士，主要研究方向为内分泌及代谢性疾病。E-mail：576497847@qq.com

李军(1972-)，女，博士，教授，主要研究方向为内分泌及代谢性疾病。E-mail: xjlijun@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.05.006

R458.5

A

1002-266X(2017)05-0019-03

2016-10-07)