离子色谱法测定诺丽果粉中常见有机酸和阴离子含量

沈宋利,林智威,陈梅兰

(浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015)

离子色谱法测定诺丽果粉中常见有机酸和阴离子含量

沈宋利,林智威,陈梅兰*

(浙江树人大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310015)

采用戴安ICS-5000离子色谱建立了诺丽果粉中14种有机酸和阴离子的分离测定方法。实验利用电导检测器对诺丽果粉中常见有机酸和阴离子进行测定。采用IonPac AS11-HC分析柱(带IonPac AG11-HC保护柱)为色谱柱,以ASRS 300(4 mm)自循环电抑制模式,KOH作为淋洗液作梯度淋洗,流速为1.0 mL/min,柱温30 ℃为色谱条件实现诺丽果粉中有机酸和阴离子理想分离。方法拥有良好的线性(r≥0.9988)、检出限(≤0.508 mg/L)、回收率(91.50%～107.22%)和重复性(RSD 0.18%～5.2%,n=8)。诺丽果粉中含有的有机酸和阴离子主要是乳酸、苹果酸、草酸、柠檬酸、氯离子、硫酸根和磷酸根。其中乳酸含量为5.893 mg/g,苹果酸含量为74.631 mg/g,草酸含量为9.631 mg/g,柠檬酸含量为10.826 mg/g,氯离子含量为27.930 mg/g,硫酸根含量为4.226 mg/g,磷酸根含量为7.747 mg/g,丙酮酸含量为3.965 mg/g,其余几种分析组分未检出。该方法准确可靠,可用于诺丽果粉中有机酸和无机阴离子的定性、定量分析。

有机酸,阴离子,诺丽果粉,离子色谱

诺丽果主要分布在南太平洋热带诸岛,菲律宾、澳大利亚、柬埔寨以及我国海南岛、西沙和台湾[1]。有研究表明诺丽果汁具有保护肝损伤的作用[2],能够提高免疫系统作用和抗肿瘤作用[3-5],具有较强的抗氧化功能[6-7],具有抗菌消炎作用[8-9],对心血管也有保护作用[10]等功效。

诺丽果粉中的有机酸是主要的营养风味物质,但经过加工后,有机酸的含量因加工工艺的不同而变化。因此,可以通过测定各种有机酸的含量来优化加工工艺。有机酸的分析方法主要有:酸碱滴定法、薄层色谱法、气相色谱法及高效液相色谱法等[11-12]。国内采用气相色谱分析法报道较多[13-15],但气相色谱法一般都要求被测物具有较高的挥发性,而许多有机酸的沸点较高,不易气化而需要在分离前对有机酸进行衍生,样品前处理繁琐费时[16];同时还需要特定酸改性气相色谱柱,因一般分析有机酸时的萃取液或吸收液大都是水溶液,这样的样品对气相色谱柱有较大的损伤。液相色谱法分析有机酸也有很多报道[17-19],但他们对含碳的有机酸专属性和灵敏度都不够[20],并且液相色谱法不能同时分析无机阴离子和有机酸。离子色谱法样品前处理简单、快速、准确、灵敏、操作简便,不受其他有机成分干扰,并可同时对共存的无机阴离子进行分离和定量等特点[21],是一种同时分析有机酸和无机阴离子的有效方法,国内已有采用离子色谱法同时分析无机阴离子和有机酸的报道[22-23]。但未见用于诺丽果粉及相关产品中14种主要有机酸和常见阴离子的同时检测的报道。本实验对诺丽果粉中起重要作用的有机酸和无机阴离子的同时分析进行了较系统的研究,通过优化梯度淋洗条件,调节流动相中的氢氧化钾浓度,一次进样同时测定14种有机酸和无机阴离子,方法应用于诺丽样品的测定,得到了满意的结果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

有机酸标准品和阴离子标准品 国家标物质中心;实验用水为超纯水(Millipore,Molsheim,France,电阻率18.2 MΩ·cm)。

诺丽果粉 由美国关岛大学University of Guam(Mangilao)杨健教授提供。

ICS-5000型离子色谱仪 美国Dionex公司,配电导检测器、ASRS 300(4 mm)自循环电抑制模式和EG40淋洗液在线发生器;KQ-300GVD型三频恒温数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BS-224S型电子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱:IonPac AS11-HC分析柱(250 mm×4 mm),IonPac AG11-HC保护柱(50 mm×4 mm);流动相:KOH梯度淋洗液(程序见表1);流速:1. 00 mL/min;ASRS 300(4 mm)自循环电抑制模式;电导检测器检测;进样量:25 μL。以峰面积定量。

表1 淋洗液梯度程序Table 1 The gradient program of the eluent

注:* KOH由EG40淋洗液在线发生器在线产生。

称取0.9478 g样品,加入15 mL去离子水,室温超声15 min,超声频率45 kHz。移取0.5 mL样品稀释100倍,分别过OnGuard RP小柱和0.22 μm过滤膜,弃去初滤液后的滤液直接进样分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

2.1.1 色谱柱的选择 由于IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱是烷醇季铵功能基团中高亲水性色谱柱,对有机酸分离能力良好,柱容量高,适于复杂基体中低浓度有机酸和阴离子的分离。因此,实验选用IonPac AS11-HC阴离子交换分析柱。

2.1.2 淋洗液的选择 离子交换分离中影响被测离子保留的主要因素是离子电荷。在阴离子交换柱中分离有机酸,应选碱性淋洗液,以使有机酸离解,并以负离子形式存在,在阴离子交换柱中保留。由于OH-为强亲水性离子,易进入树脂亲水区,能同时分离与树脂亲和能力不同的无机阴离子,尤其对较难分离的羟基酸有很高的选择性,且柱后抑制产物是水,背景电导低,水负峰小,灵敏度高[24-25]。 故选KOH为淋洗液能分离对亲水性树脂亲合力强弱不同的有机酸和阴离子。由于样品中存在保留强度不同的多种有机酸和阴离子,若采用等浓度淋洗则会出现多种组分共淋洗或强保留组分无法洗脱现象[20]。故实验选择开始时用较低的淋洗液浓度增加弱保留组分的分离,然后增加淋洗液浓度以缩短强保留组分的保留时间。最佳梯度淋洗程序见表1。

2.1.3 流速的选择 分别考察了0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5 mL/min七个不同流速对14中阴离子和有机酸分离的影响,当流动相流速过大时峰形过于拥挤,甚至叠加一起,不利于分离,而流速过小时,不但分析时间过长,有一些物质不出峰,根据色谱分离情况最终确定1.0 mL/min为本法的最佳流速条件。图1和图2是流速分别为0.6、1.5 mL/min时的色谱图。

图1 流速为0.6 mL/min时的离子色谱图Fig.1 The chromatogram of flow rate 0.6 mL/min

图2 流速为1.5 mL/min时的离子色谱图Fig.2 The chromatogram of flow rate 1.5 mL/min

2.1.4 柱温的选择 在以上优化条件下,分别考察了20、25、30、35、40 ℃五个不同柱温对14种阴离子和有机酸谱分离的影响,实验结果表明,五个温度下,色谱峰的峰型及分离度有一定程度的变化,当柱温为30 ℃时,色谱峰实现了最理想的分离。在以上最佳色谱条件下,14种离子于一次进样均可达基线分离。图3为14种有机酸和无机阴离子混合标准溶液的色谱图。

表2 被测有机酸的线性范围、精密度和检出限Table 2 The detection limits and linear ranges of the organic acid

表3 被测阴离子的线性范围、精密度和检出限Table 3 The detection limits and linear ranges of the ions determined

图3 14种常见阴离子和有机酸标准色谱图Fig.3 The chromatogram of 14 anion and organic acid standards

2.2 精密度、线性范围和检出限

2.3 实际样品分析及加标回收率

为考察本方法的可靠性,采用加标进行了样品回收率实验,其结果列于表4。图4为诺丽样品分析色谱图。样品中待测组分的具体含量见表5，诺丽果粉中含有乳酸、苹果酸、草酸、柠檬酸四种有机酸及氯离子、硫酸根、磷酸根三种阴离子,其中乳酸含量为5.893 mg/g,苹果酸含量为74.631 mg/g,草酸含量为9.631 mg/g,柠檬酸含量为10.826 mg/g,氯离子含量为27.930 mg/g,硫酸根含量为4.226 mg/g,磷酸根含量为7.747 mg/g,其余几种分析组分未检出。其次加标实验还证实样品中乳酸前面的小峰为未知峰。

在实际样品检测中,发现在氯离子前面还有一个小峰,经进一步验证后发现该物质为丙酮酸,经测定丙酮酸的含量为3.965 mg/g。

表4 加标回收率结果Table 4 Determination results of recovery(n=3)

表5 样品含量Table 5 Content of the sample

注:n.a.表示样品未检出。

图4 样品中阴离子和有机酸色谱图Fig.4 The chromatogram of anion and organic acid in noni power

3 结论

本实验采用ICS-5000离子色谱仪研究了KOH淋洗液对14种有机酸和无机阴离子的保留时间的影响,确定了最佳的梯度淋洗条件,一次进样同时分离和测定了14种保留强弱不同的无机阴离子和有机酸,并应用于诺丽实际样品的测定,得到了满意的结果。实际样品测定中,诺丽果粉中含有乳酸、苹果酸、草酸、柠檬酸四种有机酸及氯离子、硫酸根、磷酸根三种阴离子,其中乳酸含量为5.893 mg/g,苹果酸含量为74.631 mg/g,草酸含量为9.631 mg/g,柠檬酸含量为10.826 mg/g,丙酮酸的含量为3.965 mg/g,氯离子含量为27.930 mg/g,硫酸根含量为4.226 mg/g,磷酸根含量为7.747 mg/g,其余几种分析组分未检出。该诺丽果粉基体复杂,经过RP柱(与反相的C18作用类似)处理后,多数极性较小的物质被吸附,留在RP柱上,不会对色谱柱造成污染。利用AS11-HC柱能够较好分离多数有机酸,并可同时对共存的无机阴离子进行分离定性和定量。方法拥有良好的线性(r≥0.9988)、检出限(≤0.508 mg/L)、回收率(91.50%～107.22%)和重复性(RSD 0.18%～5.2%,n=8),实验结果表明,所建立方法准确、简便、实用。

[1]于纯淼,李煦照,于栋华,等. 海巴檄果实诺丽(noni)生理功能研究进展[J]. 食品工业科技,2011,32(12):573-576.

[2]Wang M Y,Nowicki D,Anderson G,et al. Liver protective effects of Morinda citrifolia(Noni)[J]. Plant Foods Hum Nutrion,2008,63(2):59-63.

[3]Palu A K,Kim A H,West B J,et al. The effects of Morinda citrifolia L.(noni)on the immune system:its molecular mechanisms of action[J]. Journal Ethnopharmacol,2008,115(3):502-506.

[4]马德禄,张俊,高建华,等. 诺丽果汁的抗氧化作用及对免疫功能的影响[J]. 中国医学研究与临床,2008(6):8-10.

[5]Taskin E I,Akgün-Dar K,Kapucu A,et al. Apoptosis-inducing effects ofMorindacitrifoliaL. and doxorubicin on the Ehrlich ascites tumor in Balb-c mice[J]. Cell Biochemistry & Function,2009,27(8):542-546.

[6]Zin Mohd Z,Abdul-Hamid A,Osman A. Antioxidative activity of extracts from Mengkudu(MorindacitrifoliaL.)root,fruit and leaf[J]. Food Chemistry,2002,78(2):227-231.

[7]刘海青,刘银才,胡文婷. 海巴戟果水溶性多糖的分离纯化及清除自由基活性[J]. 生物加工过程,2008,6(3):44-47.

[8]Solomon N.The Noni Phenomenon[M]. Utah:Direct Source Publishing,1999,62-70.

[9]Su C,Wang M Y,Nowicki D,et al. Selective COX-2 inhibition of Morinda citrifolia(Noni)invitro. The proceeding of the Eicosanoids and other bioactive lipids in cancer,inflammation and related disease[C]. The 7th Annual Conference,2001:14-17.

[10]Harada S,Hamabe W,Kamiya K,et al. Preventive effect of Morinda citrifolia fruit juice on neuronal damage induced by focal ischemia[J]. Biological and Phaemaceutical Bulletin,2009,32(3):405-409.

[11]郭根和,潘葳,苏德森,等. 反相高效液相色谱法同时测定枇杷中的某些有机酸[J]. 福建农业学报,2005,20(3):198-201.

[12]金高娃,章飞芳,薛兴亚,等. 反相高效液相色谱法测定山楂中的有机酸[J]. 分析化学,2006,34(7):987-990.

[13]袁蕊,敖宗华,丁海龙,等. 高粱中脂肪酸和低分子有机酸气相色谱测定[J]. 酿酒,2011,38(4):42-43.

[14]刘炯光,袁辉. 采用大口径毛细管柱对白酒中有机酸的气相色谱分析[J]. 酿酒科技,2003,(2):74.

[15]谢文明,KO Kwang-yong,LEE Kyu-seung. 土壤和白菜中低分子量有机酸的气相色谱分析[J]. 岩矿测试,2009,28(2):97-100.

[16]杨东伟,李晓静,王芬,等. 高效液相色谱法测定葡萄酒中11中有机酸含量[J]. 安徽农业科学,2013,41(3):1286-1287.

[17]况作品,周亚菁,谢晓梅,等. 高效液相色谱法测定木瓜水溶性有机酸含量的样品处理方法研究[J]. 安徽医药,2016,20(1):54-57.

[18]叶秀娟,郑炯,索化夷,等. 高效液相色谱法测定永川豆豉中的6种有机酸[J]. 食品科学,2014,35(20):114-118.

[19]孙喜房,李春,武占省,等. HPLC测定葡萄酒中有机酸方法的研究[J]. 石河子大学学报(自然科学版),2006,24(6):728-731.

[20]吴飞燕,贾之慎,朱岩. 离子色谱电导检测法测定酒中有机酸和无机阴离子[J]. 浙江大学学报(理学版),2006,33(3):312-315.

[21]刘静,李静,聂黎行,等. 离子色谱法同时测定注射用丹参(冻干)中有机酸和无机阴离子[J]. 药物分析杂志,2012,32(10):1774-1777.

[22]史亚利,刘京生,蔡亚岐,等. 离子交换色谱法同时测定啤酒中有机酸和无机阴离子[J]. 分析化学,2005,33(5):605-608.

[23]庄昌清,岳红,谢丽萍. 离子色谱法测定聚乳酸(PLA)降解产物中3种有机酸阴离子[J]. 中国无机分析化学,2012,2(3):58-59.

[24]屈峰,刘克纳,牟世芬. 离子色谱法同时测定柠檬酸发酵液中无机阴离子和有机酸[J]. 环境化学,1995,14(5):466-470.

[25]沈宏,严小龙,郑少玲,等. 菜豆有机酸和无机阴离子同时分析的离子色谱法[J]. 华南农业大学学报,2001,22(2):8-10.

[26]曹家兴,杭义萍,陆建平,等. 固相萃取-离子色谱法测定甘蔗糖蜜及糖蜜酒精废液中的非氮有机酸和无机阴离子[J]. 色谱,2010,28(9):893-897.

Determination of organic acid and anion in noni powder by ion chromatography

SHEN Song-li,LIN Zhi-wei,CHEN Mei-lan*

(College of Biology and Environmental Engineering,Zhejiang Shuren University,Hangzhou 310015,China)

A ion chromatography method(IC)was developed for the determination of 14 organic acid and anion in noni powder by Dionex ICS-5000 with conductivity detection. The separation of the organic acids and inorganic anions in noni powder was performed on IonPac AS11-HC analytical column plus IonPac AG11-HC guard column,ASRS 300(4 mm)electric inhibition model,and KOH as gradient eluent at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃. At the above chromatographic conditions,ideal separation of 14 organic acid and anion can be obtained. The analysis mothod exhibited a good linear relationship(r≥0.9988)at the range of 1～50 mg/L,low detection limit(≤0.508 mg/L),good recovery(91.50%～107.22%),and good precision(RSD% ranging from 0.18% to 5.2%,n=8).The organic acids and inorganic anions component within Noni powder were lactic acid,malic acid,oxalic acid,citric acid,chloride,sulfate and phosphate.The concentration of those analytes that mentioned above were 5.893,74.631,9.631,10.826,27.930,4.226,7.747 mg/g respectively while some of which were not detected.This developed method was simple,efficient,and suitable for the determination of these 14 organic acid and anion in noni powders.

organic acid;anion;noni polwder;ion chromatography

2016-06-20

沈宋利(1990-)，男，本科，助理工程师，研究方向：色谱分离分析，E-mail：1139106881@qq.com。

*通讯作者:陈梅兰(1964-)，女，硕士，教授，主要从事色谱分离分析，E-mail：rain-lake@163.com。

浙江省家具检测技术研究重点实验室(2016J04)。

TS201.1

A

:1002-0306(2017)03-0305-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.050