古法炮制地黄与市售地黄成分的比较

杨飞飞，李胜男，郭怀忠，杨茹敏

(1.河北大学 药学院，河北 保定 071002； 2.安国市益源康中药材有限公司，河北 安国 071200)



古法炮制地黄与市售地黄成分的比较

杨飞飞1，李胜男1，郭怀忠1，杨茹敏2

(1.河北大学 药学院，河北 保定 071002； 2.安国市益源康中药材有限公司，河北 安国 071200)

通过高效液相色谱(HPLC)指纹图谱技术来研究古法炮制生、熟地黄药材与当前市售生、熟地黄的品质差异，为地黄药材质量标准的完善以及炮制方法的研究提供参考.样品采用甲醇提取，使用Welchrom C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm )，乙腈-0.1% (体积分数) 磷酸水溶液梯度洗脱，多波长紫外检测器检测，流速 1.0 mL/min，进样量 20 μL，柱温 35 ℃.分别对生、熟地黄的HPLC指纹图谱的共有峰面积进行比对.古法炮制地黄与市售地黄所含成分有显著差异，古法竹刀切片制生地黄与古法酒蒸炮制熟地黄，其主要成分梓醇、毛蕊花糖苷含量普遍高于市售生、熟地黄；而5-羟甲基糠醛的含量远低于市售品.

生地黄；熟地黄；指纹图谱；HPLC；炮制

地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的块根，在临床上应用广泛，生地黄、熟地黄是其2种入药形式.鲜地黄缓缓烘焙至约八成干，制得生地黄；生地黄照酒炖法或蒸法炮制，即得熟地黄.生地黄性寒、味甘，归心、肝、肾经，具有清热凉血，养阴生津的功效.熟地黄性微温、味甘，归肝、肾经，具有补血滋阴，益精填髓的功效[1].生地黄炮制成熟地黄后其药性由寒转温，功能由清转补，2者在药性、药效上有着极大的差异.地黄的炮制方法及炮制品的质量会极大影响其临床疗效.

中药炮制是根据中医临床用药理论和药物配制的需要，将药材进一步加工的传统工艺，与药效有着密切的关系，且古法炮制中多有禁忌[2].如生地黄的炮制，《雷公炮炙论》曰，“凡使生地黄……，勿犯铜铁器，令人肾消并发白，男损荣，女损卫也”，因此古法加工生地黄时多用木刀或竹刀切制[3].酒制熟地黄是地黄传统制法之一，且古法记载炮制时要求达到“九蒸九晒”，方得质量上乘地黄药材[4].现今地黄加工炮制在辅料使用及工艺上多有改变，并简化炮制工艺，且不完全统一，且多数仅以“黑如漆，甜如饴”等笼统的性状变化作为达到炮制终点的标准，缺少客观的质量检测指标.以蒸制地黄为例，基于工业化要求，目前多采用一次蒸制，蒸熟即可，但《本草纲目》中记载“今布中惟以酒煮熟售者，不可用.”《备急千金要方》中亦记载“候好晴日便早蒸之,即暴于日中,夜置汁中以物盖之,明朝又蒸,古法九遍止,今但看汁尽色黑熟,蒸三五遍亦得”.不同的炮制过程必然会造成地黄药材质量出现差异.相关研究表明，地黄炮制前后，其主要成分梓醇、苷类、5-羟甲基糠醛等会发生明显的变化[5-6].本文参考文献[7]，建立了高效液相色谱测定地黄指纹图谱的方法，并利用该方法对采用竹刀切片制生地黄，古法多次酒蒸法制熟地黄，以及市售地黄进行研究，比较其成分差异，为开展地黄药材炮制规范化研究提供参考.

1 材料与试剂

1.1 药材

市售生地黄(编号：生地黄Ⅰ-Ⅶ)、熟地黄(编号：熟地黄Ⅰ-Ⅶ)分别购自7家不同的药店.古法竹刀切片制生地黄(编号：生地黄Ⅷ-Ⅹ)、古法多次酒蒸法制熟地黄(编号：熟地黄Ⅷ-Ⅹ，自制)各3批.古法炮制生、熟地黄样品均由安国市益源康中药材有限公司提供，所有药材均经河北大学药学院徐宏欣老师鉴定为正品.

1.2 仪器与试药

P3000高效液相色谱仪(北京创新通恒科技有限公司)；Welchrom C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm，上海月旭科技股份有限公司)；AG204电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；TG16-W微量高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；HH-601超级恒温水浴(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司).

梓醇(批号110808-200508)和毛蕊花糖苷(批号111530-201007)对照品均购自中国食品药品检定研究院；5-羟甲基糠醛(5-HMF)为实验室参考文献[8-9]自制(称取葡萄糖2.0 g，以HCl-CrCl3为复合催化体系，在温度200 ℃下反应15 min制得，经HPLC测定无杂峰，符合定性要求)；甲醇、乙腈(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司).

2 方法

2.1 古法炮制[3-4]

鲜地黄洗净，毛刷去皮，竹刀切片，晾至八成干，制得生地黄.将适量黄酒与生地黄倒入坛中，用糯米制泥封口，焖蒸24 h，取出，晒至八成干，同上继续蒸晒，重复3次，制得熟地黄.

2.2 样品制备

将干燥后的各类地黄分别研磨粉碎为粗粉，即粒度范围控制在能全部通过二号筛.精密称取药材粉末1.0 g，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流提取1.5 h，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，旋蒸浓缩至近干，残渣用体积分数15%甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，定容，摇匀，经 0.45 μm 滤膜过滤，备用.

2.3 色谱条件

Welchrom C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm )，流速1.0 mL/min，生地黄检测波长为210、334 nm，熟地黄检测波长为334、284 nm，柱温35 ℃，进样量20 μL.二元梯度洗脱，流动相A为乙腈，B为体积分数0.1% 磷酸水溶液(洗脱程序：0～5 min，1%A；5～10 min，1%～4%A；10～22 min，4%～6%A；22～30 min，6%～18%A ；30～60 min，18%～25%A；60～80 min，25%～35%A).

2.4 精密度实验

取同一样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行HPLC分析，连续进样5次，记录保留时间及各峰峰面积.

2.5 重复性实验

取同一药材5份，按“2.2”项下方法操作，制备样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行HPLC分析，记录保留时间及各峰峰面积.

2.6 稳定性实验

同一样品溶液，室温存放，分别于0、4、8、12、24、48 h，按“2.3”项下色谱条件进行HPLC分析，记录保留时间及各峰峰面积.

3 结果与分析

3.1 古法炮制地黄与市售地黄性状对比

古法竹刀制生地黄与市售生地黄，古法炮制熟地黄与市售熟地黄在性状上均存在较大差异，对比图如图1.

a.竹刀制生地黄；b.市售生地黄；c.古法制熟地黄；d.市售熟地黄.

由图1中a、b可以看出，市售生地黄呈深棕色，而竹刀切制的生地黄颜色明显较浅.推测可能是市售生地黄接触铁器，使某些化学成分发生变化而使得其颜色变深.由图中c、d可看出，2种熟地黄表面皆是乌黑色，但古法制熟地黄有光泽，并且与市售熟地黄相比黏性大，质柔软而带韧性，不易折断.

3.2 色谱条件的建立及优化

210、334 nm分别是2015年版《中国药典》规定的生、熟地黄检测成分梓醇、毛蕊花糖苷的吸收波长[1].284 nm是5-HMF的检测波长，它是文献[5]报道地黄炮制前后变化最显著的成分之一.因此，本实验参考2015年版《中国药典》生、熟地黄的含量测定色谱条件，并对流动相梯度程序进行优化，以获得尽量多的共有峰信息，最终确定的色谱条件见2.3.采用多个波长进行分析，样品间可识别的共有峰增加，能更准确地反映药材间的差异.

3.3 方法学验证

在精密度、重复性和稳定性实验中，测得其共有峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均在1.1%和4.7%以内，表明仪器的精密度和方法重复性良好，样品在室温下48 h内稳定.

3.4 生地黄样品测定

取“2.2”项下生地黄样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行HPLC分析.生地黄代表性HPLC指纹图谱见图2、3、4、5.

通过向样品中添加对照品来确定样品中的梓醇和毛蕊花糖苷峰.在210 nm下，生地黄共11个共有峰(图2)，所有批次梓醇峰面积比较见图3.由图3可见，古法制生地黄梓醇峰面积整体高于市售生地黄.在334 nm波长下，共7个共有峰(图4)，由图5可看出，古法制生地黄(Ⅷ-Ⅹ)中毛蕊花糖苷峰面积皆远远高于其他批次药材.利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004版A)对不同波长下的地黄HPLC指纹图谱进行了相似度分析，发现在210 nm下，除生地黄Ⅱ外，其余批次相似度皆大于0.873；在334 nm下，除生地黄Ⅱ外，其余皆大于0.823，生地黄Ⅱ的梓醇和毛蕊花糖苷含量都很低，这可能是由于药材本身的品质差异或炮制储藏不当造成的.相对来说，3批古法制生地黄的相应成分含量较高.

a.生地黄Ⅰ；b.生地黄Ⅷ；1.梓醇

图3 所有批次生地黄梓醇峰面积比较

a.生地黄Ⅰ；b.生地黄Ⅷ；2.毛蕊花糖苷

图5 所有批次生地黄毛蕊花糖苷峰面积比较

3.5 熟地黄样品测定

取“2.2”项下熟地黄样品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行HPLC分析.熟地黄药材代表性HPLC指纹图谱见图6、7、8、9.

334 nm下熟地黄共有峰有8个(图6)，由图7可知，古法制熟地黄中毛蕊花糖苷峰面积均明显高于各批次市售熟地黄，此波长下指纹图谱相似性皆大于0.874.在284 nm下，熟地黄指纹图谱差异较大，共有峰少，并且其相似度较低，在0.555～0.659内，见图8.由图9可知，市售熟地黄的5-HMF峰面积皆远远高于自制熟地黄，其中熟地黄Ⅲ的峰面积甚至达到2×107.

熟地黄中的5-HMF主要来自于炮制加热过程中单糖的脱水转化，加热时间和温度对其产生量有重要影响.在较短的时间内单糖不断脱水转化，表现为5-HMF随加热时间的延长而增加[10]，但本文所制熟地黄中5-HMF含量极低，可能主要是因为本文的古法地黄炮制方式历时较长，在长时间的蒸晒过程中，转化相对较完全的5-HMF本身不稳定，易发生降解，并且5-HMF可随水蒸气挥发[11]，最终导致5-HMF含量大幅减少[12].

a.熟地黄Ⅰ；b.熟地黄Ⅷ； 2.毛蕊花糖苷

研究表明，5-HMF对眼睛、黏膜和皮肤有刺激性，能与人体蛋白质结合引起中毒，造成横纹肌麻痹和内脏损害，并且具有神经毒性，还具有潜在的遗传及生殖毒性[13-14].同时也有研究发现5-HMF存在一定的药理活性，如降血糖[15]、改善学习记忆[16]、抗心肌缺血[17]等.5-HMF既有一定毒性，同时又有某些药理活性，因此，该成分对熟地黄功效和毒副作用的综合影响，以及对其含量控制指标的制定尚有待进一步探讨.

图7 所有批次熟地黄毛蕊花糖苷峰面积比较

a.熟地黄Ⅰ；b.熟地黄Ⅷ；3.5-HMF

3.6 铁粉处理生地黄Ⅷ

上述结果表明，古法炮制生地黄和熟地黄中，梓醇和毛蕊花糖苷的含量明显高于市售品，推测药材与铁器的接触可能是导致这2个成分含量出现变化的主要原因，因为古法明确说明地黄的炮制“忌犯铜铁器”而应用竹刀切制.铁作为催化剂可催化一些化学反应，因此将竹刀切片制生地黄Ⅷ经铁粉处理，来考察其指纹图谱的变化.处理过程：取少量生地黄Ⅷ放入烧杯中，加入少许铁粉和水，纸封口，放置5 h后取出，置50℃烘箱中干燥，按“2.2”项下制备样品溶液，进行HPLC分析.HPLC指纹图谱见图10.

图9 所有批次熟地黄5-HMF峰面积比较

1.梓醇; 2.毛蕊花糖苷.

实验中发现，当与铁粉接触后，竹刀制生地黄药材颜色加深，干燥后与市售生地黄药材性状接近.结合图2、4和10可看出，生地黄经铁粉处理后，其梓醇、毛蕊花糖苷及其他共有峰峰面积较之前有所下降，说明铁会催化生地黄中的某些化学反应，加速某些成分含量改变，并使生地黄颜色变深，与笔者的推测基本一致.因此，在炮制生地黄药材时应遵循古法炮制原则，避免与铁等金属接触，以防止其药效成分降低或转化.

4 结论

利用高效液相色谱指纹图谱测定，考察了竹刀切制生地黄、古法制熟地黄与市售地黄药材主要成分的含量差异，并对其原因进行了初步探讨.除地黄炮制中未注意避免接触金属器具外，现今市售熟地黄炮制亦时间较短且工艺多变，未做到古法中要求的多次蒸晒，使不同方法制得药材间药效成分含量差异较大.本文为地黄药材的炮制规范化和质量标准的完善提供借鉴，保证用药的安全有效.

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(责任编辑：梁俊红)

Component comparison of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata between their ancient preparation and commercial medicines

YANG Feifei1,LI Shengnan1,GUO Huaizhong1,YANG Rumin2

( 1.College of Pharmacy,Hebei University,Baoding 071002,China; 2.Yiyuankang Traditional Chinese Medicine Co.Ltd.of Anguo,Anguo 071200,China )

The quality differences of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata between their ancient preparation and commercial medicines were investigated by high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprinting technology,providing reference for the improvement of their quality criterions and the study of their preparation processes of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata.The samples were extracted with methanol and analyzed by HPLC.The chromatographic conditions were as follows:Welchrom C18 (4.6 mm × 250 mm,5 μm ) column;acetonitrile-0.1% phosphate solution (V/V) was used as mobile phase for gradient elution;multi-wavelength UV detector;the flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 35 ℃;the injection volume was 20 μL.There were significant differences between the ancient preparation and commercial medicines through the comparison of their common peaks.The involved component contents,catalpol and acteoside of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata from ancient preparation were higher than those of commercial medicines;while 5-HMF from ancient preparation were much lower than those of commercial medicines.The preparation processes of rehmanniae radix and rehmanniae radix praeparata are necessary to be further investigated and standardized to ensure their quality and efficacy.

rehmanniae radix;rehmanniae radix praeparata;fingerprints;HPLC;preparation process

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.01.008

2016-07-06

河北省自然科学基金资助项目(H2016201221)

杨飞飞(1988—)，女，山东济南人，河北大学在读硕士研究生.E-mail：524667972@qq.com

郭怀忠(1968—)，男，内蒙古商都人，河北大学教授，博士，主要从事中药质量控制及药效学研究. E-mail：ghuaizh@aliyun.com

O657.8

A

1000-1565(2017)01-0047-09