4代甘草酸制剂对大鼠肝微粒体CYP3A酶活性影响的比较

(1.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 药学院 河北省药物质量分析控制重点实验室，

河北 保定 071002；3.河北大学 医学综合实验中心，河北 保定 071000)



4代甘草酸制剂对大鼠肝微粒体CYP3A酶活性影响的比较

赵燕燕1,2,王静1,刘丽艳3,谷聪玲2

(1.河北大学 化学与环境科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 药学院 河北省药物质量分析控制重点实验室，

河北 保定 071002；3.河北大学 医学综合实验中心，河北 保定 071000)

对国内外上市的4代甘草酸制剂对肝微粒体CYP3A酶活性的影响进行分析与比较.将CYP3A酶的特异性探针睾酮和不同浓度的甘草酸制剂加入体外大鼠肝微粒体孵育体系，用高效液相色谱法测定睾酮的羟基化代谢产物6β-羟基睾酮的含量，评价甘草酸制剂对大鼠肝微粒体CYP3A酶活性的影响.结果显示，所采用的方法符合生物样品检测标准；上市4代甘草酸制剂对CYP3A酶表现出诱导或抑制作用，第1、2代甘草酸制剂对CYP3A酶活性的影响以诱导作用为主，第3、4代甘草酸制剂对CYP3A酶活性的影响以抑制作用为主.每种甘草酸制剂对CYP3A酶活性强度的影响与给药浓度有关，结果有显著性差异.联合用药时应考虑不同甘草酸制剂对CYP3A酶活性的影响，研究结果为临床合用药物相互作用的研究以及剂量的调整提供依据.

4代甘草酸制剂；高效液相色谱法；CYP3A酶；相对活性；比较分析

临床中药物间的相互作用常是由于多种药物同时给药而导致的[1]，而影响药物间相互作用的主要因素是合用药物对肝微粒体CYP3A[2]酶活性的影响不同.药物在肝脏中进行生物转化依赖于肝微粒体中的多种酶系，其中CYP3A酶是肝微粒体中最重要的成分.某些药物可以诱导或者抑制CYP3A酶的活性[3-4]，CYP3A酶活性的变化会影响药物对人体的作用强度、毒性、药物的代谢速度以及耐药性[5]的产生.临床中多种药物合用时，其中诱导或者抑制[6-7]CYP3A酶活性的药物可以影响药物自身以及其他合并使用的药物在体内的代谢，进而影响药物疗效[8-9].因此，考察药物对CYP3A酶活性的影响对预测药物与药物间相互作用有着非常重要的意义[10-11].

在临床用药中，甘草酸制剂常与抗癌药、抗结核药、抗甲状腺药物等合用，减少后者对肝脏的损伤，起到保肝作用.目前，对甘草酸制剂的研究多集中于临床疗效的观察与统计，其对CYP3A酶活性影响的研究尚未见到.上市甘草酸制剂种类繁多，主要成分为18α-GL[12]和18β-GL[13-14]的混合物，课题组前期考察了国内外上市的4代甘草酸制剂的主成分异构体及其有关物质的含量差异与变化趋势[15]，对18α-GL、18β-GL单体和不同配比对CYP3A酶活性影响进行了研究[16].本文将大鼠肝微粒体作为研究对象[17]，以CYP3A酶为切入点，采用HPLC技术，对大鼠肝微粒体中的探针药物睾酮及其代谢产物6β-羟基睾酮进行准确定量分析，通过二者量的变化，考察甘草制剂对大鼠肝微粒体CYP3A酶活性的影响.通过对国内外上市的4代甘草酸制剂对肝微粒体CYP3A酶活性的影响进行比较与分析，为临床合用药物相互作用的研究以及剂量的调整提供依据.

1 实验部分

1.1 动物、试剂与仪器

雄性Wistar大鼠，体重约为200 g，由河北省实验动物中心提供，合格证号SCXK(冀)2013-1-003.

睾酮(德国Dr.Ehrenstorfer公司，生产批号：10519)，6β-羟基睾酮(Cerilliant公司，生产批号：FN04141413，质量浓度100 μg/mL).还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、BCA蛋白试剂盒(索莱宝科技有限公司).色谱纯甲醇、乙腈(科密欧化学试剂有限公司).磷酸氢二钠为分析纯.

第1代：甘草甜素片(75 mg/片)；第2代：国产复方甘草酸苷片(35 mg/片)，进口复方甘草酸苷片(35 mg/片)，国产复方甘草酸苷注射液(53 mg/支)，进口复方甘草酸苷注射液(53 mg/支)，国产注射用复方甘草单铵S(40 mg/支)，国产复方甘草酸苷胶囊(35 mg/粒)；第3代：国产甘草酸二胺注射液(50 mg/支)，国产甘草酸二胺肠溶胶囊(50 mg/粒)；第4代：国产异甘草酸镁注射液(50 mg/支).

液相色谱系统(包括LC-20ATVP输液泵、LabSolutions工作站、SPD-20Avp紫外-可见检测器，日本岛津公司)；台式匀浆机(瑞士Kinematica公司，型号：PT2100)；酸度计(梅特勒-托利多公司，型号：DELTA-320)；全自动酶标仪(美国BIO-TEK公司，型号：ELx800)；高速离心机(上海知信实验仪器技术有限公司，型号：H2518D)；超纯水机(成都浩康科技有限公司)；十万分之一电子分析天平(日本岛津公司，型号：AUW120D)；固相萃取仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司，型号：ASE-16)；固相萃取小柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司，型号：Cleanert ODS C18)；水浴恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司，型号：SHZ-88A).

1.2 色谱条件

色谱柱：Durashell C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：10 mmol/L Na2HPO4水溶液-乙腈-甲醇(体积比为58∶32∶10)；流速1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长245 nm；进样量10 μL.

1.3 溶液配制

精密称取一定量的睾酮标准品，放入容量瓶中，用甲醇超声溶解后加入适量甲醇定容，使其成为质量浓度为1 mg/mL的标准品储备液，于4 ℃保存备用.精密量取一定量睾酮标准品储备液，放入容量瓶中，加入适量甲醇定容，配制成200 μg/mL的标准品溶液，于4 ℃保存备用.6β-羟基睾酮标准品质量浓度为100 μg/mL，于-20 ℃保存备用.

1.4 样品处理

将片剂去糖衣研细，将胶囊中的内容物取出.准确秤取一定量的粉针剂、胶囊剂、片剂，分别放入容量瓶中，加入甲醇超声15 min，使药物溶解，冷却后加入甲醇定容，使其成为质量浓度为1 mg/mL的供试品储备液，于4 ℃保存备用.准确量取一定量的注射液、供试品储备液，分别于容量瓶中，加入适量甲醇定容，使其成为500 μg/mL供试品溶液，将供试品溶液放入4 ℃冰箱中储存备用.

大鼠肝微粒体制备：取大鼠肝脏，用生理盐水洗去血水，滤纸吸干水分.称重后迅速在冰上剪碎，按照质量比1∶4加入浓度为0.25 mol/L的蔗糖溶液，冰浴匀浆，于10 240 r/min离心15 min.取上清液，按照体积比1∶10加入浓度为88 mmol/L CaCl2溶液,置冰浴中轻搅混匀，于15 110 r/min离心15 min.取沉淀，按照体积比1∶2加入Tris-HCL重悬，定量分装到冻存管中，于-70 ℃保存，备用.制得的肝微粒体按照BCA蛋白试剂盒使用说明书测定蛋白浓度.

样品预处理：精密量取大鼠肝微粒体蛋白(1 mg/mL)，加入睾酮标准品、不同质量浓度的药物、pH=7.4的磷酸缓冲溶液，放入水浴恒温振荡器中预温孵5 min后，加入还原型辅酶Ⅱ启动反应，继续温孵30 min，于-20 ℃冷冻2 h终止反应.将已终止反应的温孵样品37 ℃解冻，于15 110 r/min离心10 min，取上清液过已活化好的固相萃取小柱，甲醇洗脱，将洗脱液用N2吹干后加入流动相复溶，涡旋混匀，0.45 μm滤膜过滤，按照“1.2”项下色谱条件上机分析.

1.5 睾酮米氏常数Km的测定

将质量浓度为10、20、40、80、160、200 μg/mL的睾酮分别加入温孵体系中，按照“1.4”项下进行样品处理，按照“1.2”项下色谱条件上机检测，测定睾酮的剩余量.Lineweaver-Burk方程为1/V=(Km/Vmax) ×1/[S]+1/Vmax.[S]为睾酮浓度，V为反应速率.以1/[S](X,mL/μg)为横坐标，以1/V(Y,(min·mg)/μg)为纵坐标作图，得到线性回归方程Y=53.71X+0.297(R=0.995 4)，酶催化最大反应速率Vmax=3.367 μg/(min·mg)，米氏常数Km=180.84 μg/mL.代谢清除率为0.019 mL/(min·mg).

2 方法与结果

2.1 专属性实验

精密量取一定量的6β-羟基睾酮和睾酮混合标准品溶液，空白肝微粒体样品、肝微粒体温孵睾酮样品、肝微粒体温孵睾酮加入混合标准品溶液样品、肝微粒体温孵睾酮加辅料样品和肝微粒体温孵睾酮加供试品样品溶液.按照“1.2”项下色谱条件上机检测，见图1.结果表明，在“1.2”项色谱条件下，6β-羟基睾酮和睾酮峰形及与其他代谢产物峰的色谱峰分离情况良好，说明本文采用的HPLC法专属性良好.

2.2 方法学考察

精密量取一定量6β-羟基睾酮和睾酮标准品，分别加入适量甲醇逐级稀释，使其成为一系列质量浓度不同的溶液，分别量取上述溶液50 μL加入到10 mL离心管中，按照“1.4”项下方法进行样品处理，按照“1.2”项下色谱条件进行上机检测.以睾酮、6β-羟基睾酮溶液质量浓度为X轴，以峰面积为Y轴，进行线性回归，得到睾酮标准曲线为Y=38 433X-6 417.6，R2=0.999 4；6β-羟基睾酮标准曲线为Y=28 782X+1 629，R2=0.999 2.以信噪比为3∶1的质量浓度确定睾酮与6β-羟基睾酮的检出限分别为0.036 、0.004 5 mg/L.以信噪比为10∶1的质量浓度确定睾酮与6β-羟基睾酮的定量限分别为0.121、0.015 mg/L.

a.混合标准品;b.肝微粒体;c.肝微粒体温孵睾酮;d.肝微粒体温孵睾酮加混合标准品;e.肝微粒体温孵睾酮加辅料; f.肝微粒体温孵睾酮加供试品.1. 6β-羟基睾酮;2.睾酮.

精密量取低、中、高质量浓度的睾酮、6β-羟基睾酮加入温孵体系中，按照“1.4”项下方法进行样品处理，按照“1.2”项下色谱条件上机检测，每个待测样品测定6次，以峰面积计算睾酮、6β-羟基睾酮的相对标准偏差(RSD)值，考察方法的日内精密度.上述样品，按照“1.2”项色谱条件，连续测定3 d，以峰面积为指标计算睾酮、6β-羟基睾酮的RSD值，考察方法的日间精密度.将上述样品放在4 ℃，分别在0、4、8、12、24 h按照“1.2”项下色谱条件上机检测，以峰面积计算6β-羟基睾酮和睾酮RSD值，考察样品稳定性.精密量取质量浓度为0.5、5、50 μg/mL睾酮和0.2 、2 、20 μg/mL 6β-羟基睾酮适量，加入灭活肝微粒体中，按照“1.4”项下方法进行样品处理，按照“1.2”项下色谱条件上机检测，每个待测样品测定6次，根据色谱峰面积计算样品中6β-羟基睾酮和睾酮含量，考察加标回收率及其相对标准偏差(RSD).日内精密度、日间精密度、稳定性、加标回收率见表1.

表1 肝微粒体样品中6β-羟基睾酮和睾酮精密度、稳定性和加标回收率

2.3 不同浓度甘草酸制剂作用下CYP3A酶活性测定

将10种甘草酸制剂分别逐级稀释成质量浓度为400、300、200、100、75、50、10、1 μg/mL的溶液，分别加入到温孵体系中，并设置空白对照，按照“1.4”项下方法进行样品处理，按照“1.2”项下色谱条件上机检测，计算6β-羟基睾酮的生成量，每个样品平行操作3管，重复实验3次.药物组6β-羟基睾酮生成量/空白对照组6β-羟基睾酮生成量即为相对酶活性.结果见表2.

表2 不同质量浓度甘草酸制剂作用下CYP3A相对酶活性

2.4 甘草酸制剂对CYP3A酶活性的影响

2.4.1 同一制剂不同质量浓度对CYP3A酶活性的影响

在温孵体系中分别加入不同质量浓度的甘草酸制剂，CYP3A相对酶活性变化趋势见图2.结果表明：第1代、

1—10.甘草酸制剂，见“表2”注释. a.0 μg/mL; b.1 μg/mL; c.10 μg/mL; d.50 μg/mL; e.75 μg/mL; f.100 μg/mL; g.200 μg/mL; h.300 μg/mL; i.400 μg/mL.

第2代甘草酸制剂以18β-GL为主，当给药质量浓度为1 μg/mL时，呈现对CYP3A酶的抑制作用，大鼠肝微粒体代谢睾酮的能力最低，CYP3A相对酶活性在65.15%～82.87%.随着给药质量浓度增大，制剂对CYP3A酶抑制作用减弱，诱导作用增强，给药浓度为10 μg/mL时，制剂对CYP3A酶活性的诱导作用最强，6β-羟基睾酮生成量最多，CYP3A酶相对活性在119.7%～170.1%.当给药质量浓度继续增大(10～100 μg/mL)，制剂对CYP3A酶的诱导作用整体呈现下降趋势，呈现弱的抑制作用.第3代和第4代甘草酸制剂主要成分以18α-GL为主，随着给药质量浓度增大，6β-羟基睾酮生成量逐渐减少，对肝微粒体CYP3A酶的抑制作用呈现质量浓度依赖性.

2.4.2 不同制剂同一质量浓度对CYP3A酶活性的影响

不同制剂同一质量浓度对CYP3A酶活性的影响见图3.从第1代到第4代甘草酸制剂中，18α-GL和18β-GL比例不同，对CYP3A酶活性的影响各不相同.当给药质量浓度为1 μg/mL时，甘草酸制剂对CYP3A酶均呈现抑制作用，异甘草酸镁注射液对CYP3A酶活性的抑制作用最弱，CYP3A相对酶活性最高为92.37%，国产复方甘草酸苷注射液对CYP3A酶活性抑制作用最强，CYP3A相对酶活性最低为65.15%.当给药质量浓度在10～50 μg/mL时，注射用复方甘草酸单铵S诱导作用最强，CYP3A相对酶活性最高为170.1%，甘草酸二胺注射液对CYP3A的抑制作用最强，CYP3A相对酶活性最低为52.55%.当给药质量浓度在75～400 μg/mL，国产复方甘草酸苷片诱导作用最强，CYP3A相对酶活性在107.1%～137.2%，异甘草酸镁注射液的抑制作用最强，CYP3A相对酶活性在27.47%～44.25%.在同一质量浓度的不同制剂对CYP3A酶活性影响差异较大，所得结果可为选择最佳药物提供参考.

ρ(甘草酸制剂)/(μg·mL-1) 1—10.甘草酸制剂，见“表2”注释.

2.4.3 同一剂型不同制剂、同一制剂不同剂型对CYP3A酶活性的影响

同一剂型不同甘草酸制剂对CYP3A酶活性的影响见图4.结果表明，同一剂型不同甘草酸制剂对CYP3A酶活性的影响各不相同，第1代和第2代甘草酸制剂主成分以18β-GL为主，如甘草甜素片和复方甘草酸苷片，对CYP3A酶活性的影响规律相同；第3代甘草酸二铵注射液和第4代异甘草酸镁注射液，主成分以18α-GL为主，作用规律相同，随质量浓度变化趋势相同，只是起效快慢和作用强度不同.同一甘草酸制剂不同剂型，如甘草酸二铵注射液和胶囊剂，复方甘草酸苷注射液和胶囊剂对CYP3A酶活性的影响规律相同，随质量浓度变化趋势相同.进口与国产的同一甘草酸制剂表现出对CYP3A酶活性作用强度不同，如进口和国产复方甘草酸苷片，进口和国产复方甘草酸苷注射液.

ρ(甘草酸)/(μg·mL-1) ρ(甘草酸)/(μg·mL-1) ρ(甘草酸)/(μg·mL-1) 1—10.甘草酸制剂，见“表2”注释；a.片剂;b.胶囊剂;c.注射剂.

3 结论

睾酮是最常用的检测CYP3A酶活性的探针药，常用其6β羟基化速率反映CYP3A酶活性.本实验应用已建立的高效液相色谱法，以睾酮为探针，通过测定6β-羟基睾酮的生成量，并将给药组所得结果与空白组相比，得到CYP3A酶相对活性，从而确定药物对大鼠肝微粒体CYP3A酶活性的影响.结果显示同一代甘草酸制剂，由于其主要成分相同，对CYP3A酶活性的影响整体趋势相同，但具体作用效果随浓度改变会有显著差异；不同代甘草酸制剂，由于甘草酸制剂主要成分及其含量差异较大，即使是同一种剂型对CYP3A酶活性影响的趋势也会有明显的差异.实验所得到的结果可为临床用药时预测药物间相互作用提供参考.

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(责任编辑：梁俊红)

Comparative analysis of the effect of the four generations of glycyrrhizin preparations on rat liver microsomal CYP3A activity

ZHAO Yanyan1,2,WANG Jing1,LIU Liyan3，GU Congling2

(1.College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China; 2.Key Laboratory of Pharmaceutical Quality Control of Heibei Province，College of Pharmaceutical Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China; 3.Experimental Center of Medicine,Hebei University,Baoding 071000,China)

To analyze the effects of four generations of glycyrrhizin preparations on the activity of CYP3A enzymes of rat liver microsomes by HPLC,rat liver microsomes were incubated with various concentrations of glycyrrhizin preparations and testosterone in vitro.The effect of CYP3A activity of glycyrrhizin preparations was evaluated by the amount of 6β-hydroxy testosterone which was determined by HPLC.The result illustrated that this method met the standard for biological sample.The glycyrrhizin preparations could induce or inhibit the enzyme activity of rat liver CYP3A in vitro.The first and second generations of glycyrrhizin preparations have an obvious inducing effect on the enzymic activity of CYP3A in rats. On the contrary,the third and fourth generations of glycyrrhizin preparations have a marked inhibition effect on CYP3A enzymes.The influence of glycyrrhizin preparation on CYP3A enzymes activity varies with the concentration.The research in this paper indicates that it is importance to select a reasonable glycyrrhizin preparation in case of drug interation.The result of this paper can provide reference for the research of clinical co-administrated drugs and dose adjustment.

four generations of glycyrrhizin preparations; HPLC; CYP3A;relative activity; comparative analysis

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.01.006

2016-04-20

河北省自然科学基金资助项目(H2013201203)；河北大学医学学科专项资金建设资助项目(2014A1003)

赵燕燕(1960—)，女，天津人，河北大学教授，主要从事药学以及将现代分离技术用于临床、药学、食品、环境等方面的研究工作.E-mail：zhaoyany606@126.com

R917

A

1000-1565(2017)01-0031-08