维格列汀基因毒性杂质的气相色谱—质谱分析方法学验证

贾世良, 王珊珊，陈相峰＊，朱 文，林云良，李 磊

（1. 山东省分析测试中心, 山东 济南 250014； 2. 山东省科技统计分析研究中心, 山东 济南 250014）

维格列汀基因毒性杂质的气相色谱—质谱分析方法学验证

贾世良1, 王珊珊1，陈相峰1＊，朱 文2，林云良1，李 磊1

（1. 山东省分析测试中心, 山东 济南 250014； 2. 山东省科技统计分析研究中心, 山东 济南 250014）

报道了一种测定维格列汀中的氨基甲酸脂类和对甲苯磺酸脂类基因毒性杂质的气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法。采用选择离子监测（SIM）模式，在 0.2～2 μg/mL 浓度范围内，四种目标化合物线性相关系数均大于 0.996 0，样品的加标回收率在 86.94%～113.11%之间，通过方法精密度实验，方法精密度（RSD%）在 5.37%～7.96%之间，精密度良好。该方法能完全满足维格列汀基因毒性杂质氨基甲酸脂类和对甲苯磺酸脂类的检测。

气相色谱-质谱联用；氨基甲酸脂类；对甲苯磺酸脂类；选择离子模式；方法精密度

近年来，随着人们生活水平的提高，我国糖尿病患病率迅速增加[1]。糖尿病严重危害着人类健康，最近的一项研究显示，我国 20 岁以上人群中男性和女性的糖尿病患病率分别为 10. 6%和 8. 8%，总体患病率为 9. 7%[2-4]。虽然目前有大量治疗药物，但长期血糖控制仍不理想，导致了大量的糖尿病并发症，如心脏病，中风，截肢，失明，肾病，周围神经病变等[5-7]。研究显示，二肽基肽酶-4( DPP-4)抑制剂维格列汀可以有效控制血糖，同时具有减少胰岛 β 细胞凋亡，促进 β 细胞新生的作用[8]。尤其 2型糖尿病患者口服维格列汀通常耐受性良好，大多数不良反应为轻到中度，且与剂量无相关[9]。老年患者（大于 65 岁）对维格列汀的耐受性也较好[10]，维格列汀引起低血糖的风险较低，且不增加体重[11]。已广泛用于糖尿病治疗。维格列汀基因毒性杂质是指在维格列汀合成工艺里存在的反应副产物，根据维格列汀合成工艺路线[12,13]，确定维格列汀中可能存在氨基甲酸脂类和对甲苯磺酸脂类。本文建立了GC-MS 测定维格列汀基因毒性杂质中的氨基甲酸脂类和对甲苯磺酸脂类。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

维格列汀样品购买于当地医院、二氯甲烷(色谱纯)、Agilent 6890N-5973N GC/MS 气相色谱-质谱联用、Mettle AB265-S 型电子分析天平。

1.2 溶液配制

稀释溶剂：二氯甲烷。对照品储备液 1：分别取氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯 100 mg（精确到 0.000 1g）到 10 mL的棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容到刻度，浓度为10 mg/mL，作为对照品储备液 1。对照品溶液：精密量取对照品储备液适量，配制成每 1mL 二氯甲烷分别含有 100 μg 氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯的溶液，浓度为100 μg/mL，作为对照品储备液 2；取该溶液 100 μL到 10 mL 的棕色容量瓶中，并用二氯甲烷定容到刻度，浓度为 1.0 μg/mL，作为对照品溶液。供试品溶液：精密称取 200 mg 维格列汀样品，到 25 mL 具塞刻度试管中，加入 10 mL 的二氯甲烷超生萃取 10 min，静置，全部转移到另一只刻度试管中，清洗样品管 3 次，每次 1mL，全部转移清洗液；并用氮吹仪将其浓缩至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，静置，直接取上清液 1mL 于进样瓶中，待用。

1.3 分析条件

气相色谱-质谱联用仪及气相条件：气相色谱-质谱联用仪：Agilent 6890N-5973N GC/MS。

色谱柱： DB-624（30 m×0.25 mm i.d., 1.4 μm）；柱温箱升温程序：起始温度 60oC，以 10oC/min 的速率升温至 220oC，保持 10 min, 进样口温度：280oC，分流模式采用脉冲不分流模式；载气使用高纯氦气；流速为 1.0 mL/min；进样体积：1.0 μL；质谱采集模式采用选择离子监测（SIM）模式，离子源温度为 230oC。

2 结果与分析

2.1 专属性实验

（1）空白溶剂：二氯甲烷。

（2）取 100 µg/mL 的混合标准溶液 0.1mL，用二氯甲烷稀释到 1mL，浓度为 10 µg/mL。用自动进样器取 1.0 µL 进行气质分析，记录离子流图，质谱扫描模式为 Scan 模式。经过质谱分析得出四种物质的出峰顺序和保留时间。结果见表1。

表1 专属性结果Table 1The result of the specific test

（3）空白样品溶液：精密称取 200 mg 精制维格列汀样品，到 25 mL 具塞刻度试管中，加入 10 mL的二氯甲烷超生萃取 10 min，静置，全部转移到另一只刻度试管中，清洗样品管 3 次，每次 1mL，全部转移清洗液；并用氮吹仪将其浓缩至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，静置，取 1μL 进样。

（4）样品加标溶液配制：精密称取 200 mg 精制维格列汀样品，到 25 mL 具塞刻度试管中，向样品中加入 100 μL 对照品储备液 2；然后，加入 10 mL的二氯甲烷超生萃取 10 min，静置，全部转移到另一只刻度试管中，清洗样品管 3 次，每次 1mL，全部转移清洗液；并用氮吹仪将其浓缩至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，静置，取 1μL 进样。

从表可以得出：精制维格列汀样品中不含有氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯；并且样品中各杂质峰对目标化合物的检测无干扰。

2.2 标准曲线、检出限及定量限

精密量取对照品储备液适量，分别配制成每 1mL二氯甲烷中含有目标化合物（氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯）为 2、0.8、0.5、0.4、0.1μg 的溶液。按上述操作条件进行测定，以质量浓度(X)/(μg/mL)，对相应的峰高(Y)进行线性回归。

精密量取上述溶液各 1.0 μL 注入气质色谱仪，记录峰面积。以目标物浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标作回归曲线，计算回归方程及相应的线性回归系数。获得四种化合物的标准曲线及相关系数，并得到其检出限和定量限(表 2)。

表2 标准曲线实验结果Table 2 The result of the standard curve test

表3 对照品实验结果Table 3 The results of reference substance test

2.3 方法回收率及精密度

取对照品溶液平行 4 份，各取 1μL 进样，记录色谱图和峰面积，以其峰面积的平均值计算回收率见表3。

本品最大日剂量 100 mg，以 TTC 1.5 μg/d 计算，目标物控制限度应为 0.0015%(15ppm)。因此在

120%(18ppm)、80%(12ppm) 两个浓度水平上测定回收率。精密称取 200 mg 精制维格列汀样品，到25 mL 具塞刻度试管中，向维格列汀中用 50 μL 进样针加入 100 μg/mL 对照品储备液 36、24 μL。即高浓度加标水平浓度为 1.2 μg/mL；低浓度加标水平浓度为 0.8 μg/mL。向其中加入 10 mL 的二氯甲烷超生萃取 10 min，静置，全部转移到另一只刻度试管中，清洗样品管 3 次，每次 1mL，全部转移清洗液；并用氮吹仪将其浓缩至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，静置，待用，每个浓度水平平行制备3份。

精密量取上述供试品溶液 1.0 µL 注入气质联用色谱仪，记录离子流图。结果见表4。

表4 方法的加标回收率Table 4 The recoveries of the spiked standard solutions

结论：样品在2个加标浓度水平下回收率在86.94 %～113.11%之间，平均回收率在 92.34%～107.25%之间，回收率良好。

精密称取 200 mg 精制维格列汀样品，到 25 mL具塞刻度试管中，向维格列汀中用 50 μL 进样针加入 100 μg/mL 对照品储备液 30 μL。即精密度加标水平浓度为 1.0 μg/mL。向其中加入 10 mL 的二氯甲烷超生萃取 10 min，静置，全部转移到另一只刻度试管中，清洗样品管 3 次，每次 1mL，全部转移清洗液；并用氮吹仪将其浓缩至 3 mL 以下，最后用二氯甲烷定容到 3 mL，静置，待用，平行制备 5 份。分别进样 1.0 μL，记录色谱图和峰面积，以峰面积计算各相对标准偏差，结果见表5。

表5 方法精密度试验结果Table 5 The results of theprecision test

结论：RSD 值在 5.37%～7.96%之间，符合方法学要求。

2.4 溶液稳定性实验

取对照品溶液 1mL 于进样瓶中，每 4 h 进样一次，共进样5次，以目标物以及杂质峰的峰面积来评定溶液的稳定性。实验结果见表6。

表6 溶液稳定性试验Table 6 Solution stability test

由表6看出各目标化合物（氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯、对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯）的 RSD 值在 4.5%以内，符合溶液稳定性的要求。

2.5 样品检测

样品均未检出各目标杂质。中间体 1～3 样品中检出氨基甲酸乙酯。峰面积 A与浓度 C（ppm）之间结果见表 7。样品检测加标谱图见图 1。

表7 中间体1-3批次样品检测结果Table 7 The detection result of the Intermediate 1-3

图1 样品加标溶液的色谱图Fig. 1The chromatogram of the spiked standard solution

3 结 论

本研究建立了维格列汀中氨基甲酸酯类和对甲苯磺酸脂类基因毒性杂质的分析方法。分析方法的线性范围、检测限、平均加标回收率和精密度等指标均能满足分析要求。此分析方法快速、准确、灵敏度高，能够满足测定要求，可用于维格列汀基因毒性杂质氨基甲酸酯类和对甲苯磺酸脂类的检测。

［1］李艳玲，张星光，陈彬，等 . 维格列汀对新诊断 2 型糖尿病的疗效及对血糖波动的影响研究[J]．中国全科医学，2014，17 ( 28) : 3350－3352.

［2］戴梦昭. 维格列汀联用二甲双胍治疗 2 型糖尿病疗效和安全性的Meta 分析[J]. 中国全科医学，2013，16 ( 8) :2714 -2717．

［3］W. Yang, J. Lu, J. Weng, et al.prevalence of diabetes among men andwomen in China [J]. New England Journal of Medicine，2010，362( 12) : 1090 -1101

［4］苏永，吕丽芳，李全忠，等.维格列汀与 A-糖苷酶抑制剂治疗 2 型糖 尿 病 的 随 机 对 照 临 床 试 验 [J]. 中 国 新 药 杂 志 ， 2014 ， 23（22）:2655-2658.

［5 ］占美，吴逢波，徐珽 ，等.维格列汀与其他口服降糖 药对照治疗 2型 糖 尿 病 的 Meta 分 析 [J] .中 国 医 院 药 学 杂 志 ， 2011,31（21）:1824-1827

［6］L. Ryden, E. Standl, M. Bartnik, et al.Guidelines on Diabetes,pre-Diabetes, and Cardiovascular Diseases: Executive Summary: The Task Force on Diabetes and Cardiovascular Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Association for the Study of Diabetes (EASD)[J]. European Heart Journal，2007，28（1）:88-136．

［7］A. Lee,p.patrick, J. Wishart, et al. The effects of miglitol on glucagon-likepeptide-1secretion and appetite sensations in obese type 2 diabetics[J]. Diabetes Obesity and Metabolism，2002，4（5）:329-335

［8］B. Ahren, A. Schweizer, S. Dejager, et al. Mechanisms of action of the dipeptidylpeptidase-4 inhibitor vildagliptin in humans[J]. Diabetes Obesity and Metabolism，2011，13（9）:775-783．

［9］W. D. Strain, L. Valentina,K. Wolfgang, et al.Individualised treatment targets for elderlypatients with type 2 diabetes using vildagliptin add-on or lone therapy (INTERVAL):a 24 week, randomised, double-blind,placebo-controlled study[J]. Lancet ， 2013 ， 382（9890）:409-416.

［10］A. Schweizer, S. Dejager, E. Bosi. Comparison of vildagliptin and metformin monotherapy in elderlypatients with type 2 diabetes: a 24-week, double-blind, randomized trial[J].Diabetes Obesity and Metabolism，2009，11（8）:804-812.

［11］安富荣，崔岚，王勤. 治疗型糖尿病新药—维格列汀[J]. 中国新药与临床杂志，2012，31（10）:574-578.

［12］M. Eckhardt,E. Langkopf, H. Frank, et al. 8-(3-(R)-aminopiperidin-1-yl)-7-but-2-ynyl-3-methyl-1-(4-methyl-quinazolin-2-ylmethyl) -3,7-dihydropurine-2,6-dione (BI 1356), a highlypotent, selective, long-acting, and orally bioavailable DPP-4 inhibitor for the treatment of type 2 diabetes[J]. Journal of Medicinal Chemistry，2007， 50（26）:6450-6453.

［13］史娇阳，吴雪松，岑均达.维格列汀合成路线图解[J]. 中国医药工业杂志，2013，44（2）:206-208.

Validation of GC-MS Method for Determining Genotoxic Impurities in Vildagliptin

JIA Shi-liang1, WANG Shan-shan1, CHEN Xiang-feng1*, ZHU Wen2, LIN Yun-liang1, LI Lei1
（1. Shandong Analysis and Test Centre, Shandong Jinan 250014，China; 2. Shandong Science and Technology Statistics Centre, Shandong Jinan 250014，China）

A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method was established to determine carbamic acid lipid andp-toluene sulfonic acid lipid in vildagliptin. Selective ion monitoring (SIM) mode was used for four genotoxic imputities in vildagliptin. The linear correlation coefficients were all above 0.996 0 in the range from 0.2 μg/mL to 2 μg/mL. The recoveries of the spiked samples were between 86.94% and 113.11%. Theprecision of method (RSD%) was from 5.37% to 7.96%. These results showed that the method was accurate, and was able to determine carbamic acid lipid andp-toluene sulfonic acid lipid in vildagliptin.

GC-MS; Carbamic acid lipid;p-toluene sulfonic acid lipid; Selected ion mode;precision

O 657

： A

： 1671-0460（2017）02-0370-04

2017-01-10

贾世良（1990-），男，河南省许昌人，助理实验师，硕士，2017 毕业于山东科技大学，研究方向：质谱分析。E-mail：jia19900315@126.com。

陈相峰（1981-），男，副研究员，博士，研究方向：复杂体系质谱分析研究。E-mail：xiangfchensdas@163.com。