小G蛋白Rab5对表达在HEK293细胞上的大电导钙激活钾通道的影响

周丹，刘雪茹，李涛，刘力，谭晓秋，刘玉林

(1西南医科大学附属医院，四川泸州646000；2西南医科大学心血管医学研究所)

小G蛋白Rab5对表达在HEK293细胞上的大电导钙激活钾通道的影响

周丹1，刘雪茹1，李涛2，刘力1，谭晓秋2，刘玉林1

(1西南医科大学附属医院，四川泸州646000；2西南医科大学心血管医学研究所)

目的 探讨小G蛋白Rab5对HEK293细胞大电导钙激活钾通道(BKCa)的影响。方法 将对数生长期HEK293细胞，随机分为Control组、Rab5WT组、Rab5CA组和Rab5DN组。采用脂质体转染法进行转染，Control组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和对照质粒pcDNA3.1，Rab5WT组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5WT质粒，Rab5CA组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5CA质粒，Rab5DN组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5DN质粒，每组两种质粒总量为4 μg，按质量比1∶1共转染至3.5 mm培养皿中。转染72 h、荧光显微镜下观察转染效率在70%以上时，采用膜片钳、Western blotting法和流式细胞术观察Rab5对HEK293细胞BKCa的作用。结果 与Control组比较，Rab5WT组、Rab5CA组BKCa全细胞电流密度明显增加，而Rab5DN组明显降低；Rab5WT组、Rab5CA组BKCa膜蛋白的相对表达量明显升高，而Rab5DN组明显降低(P均<0.05)；Rab5WT组、Rab5CA组Flag+/GFP+明显增加，而Rab5DN组明显降低(P均<0.05)。结论 Rab5能够明显增加表达在HEK293细胞上的BKCa电流及细胞膜上的表达，并可促进BKCa向质膜的转运过程。

小G蛋白家族；大电导钙激活钾通道；蛋白转运；基因转染

大电导钙激活钾通道(BKCa)是血管平滑肌细胞膜上重要的离子通道， 可携带70%～80%的外向

电流，在调节血管张力和血压中发挥重要作用[1]。我们前期研究发现， BKCa是众多舒血管药物的作用靶点，其功能活动异常与高血压等密切相关[2,3]。BKCa蛋白在内质网合成、高尔基体加工后，需经过一系列复杂机制组装并转运到质膜上，才能发挥生理功能；因此，细胞膜上BKCa蛋白的表达水平及调控对其功能的发挥至关重要。小G蛋白家族成员Rab在质膜内侧及多种胞内囊泡结构中存在，具有调节囊泡转运和离子通道活动等功能。既往研究发现，Rab蛋白可参与多种离子通道转运的调控过程[4]。2012年9月～2015年12月，本研究观察了Rab5对表达在HEK293细胞上BKCa转运过程的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 HEK293细胞，购自美国ATCC公司。含人血管平滑肌BKCaα亚单位的表达质粒pcDNA3.1-hSlo1，由本实验室保存。Flag和GFP双标记hSlo1表达质粒(简称Flag-hSlo1-GFP质粒)，含有人Rab5小G蛋白野生型(WT)、显性负向型(DN)、持续激活型(CA)的表达质粒(pcDNA3.1)，由本实验室通过逆转录PCR和定点突变完成，并经测序验证。EPC-10膜片钳系统，德国HEKA公司；凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司；流式细胞仪，美国BD公司；CO2培养箱，美国Thermo公司。质粒提取试剂盒，美国Omega公司；Lipotamine2000脂质体转染试剂，美国Life Science公司；Western blotting凝胶配制试剂，江苏碧云天生物技术研究所；膜蛋白提取试剂盒，美国Pierce公司；APC标记的Flag一抗，日本MBL公司；其余常用试剂购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 细胞培养和转染 HEK293细胞置于含10% FBS的DMEM高糖培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中传代培养。当细胞培养至对数生长期，细胞融合至80%时，随机分为Control组、Rab5WT组、Rab5CA组和Rab5DN组，采用脂质体转染法进行转染。Control组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和对照质粒pcDNA3.1，Rab5WT组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5WT质粒，Rab5CA组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5CA质粒，Rab5DN组转染Flag-hSlo1-GFP质粒和Rab5DN质粒，每组两种质粒总量为4 μg，按质量比1∶1共转染至3.5 mm培养皿中。转染72 h，荧光显微镜下观察转染效率在70%以上时进行下一步实验。

1.3 BKCa电流记录 使用全细胞膜片钳记录BKCa电流，电极阻抗3～5 mΩ。记录BKCa电流的浴液：NaCl 137.0 mmol/L、KCl 5.9 mmol/L、MgCl21.2 mmol/L、CaCl21.8 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L，使用NaOH将浴液pH调至7.4；电极液：KCl 128.0 mmol/L，NaCl 12.0 mmol/L，MgCl24.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，EGTA 1.0 mmol/L，使用KOH将电极液pH调至7.2，根据文献[5]加入适量的CaCl2，使细胞内游离Ca浓度为0.1 μmol/L。钳制电位为-80 mV，刺激方案采用阶跃刺激方案：-80～60 mV，时程400 ms。

1.4 BKCa膜蛋白表达检测 采用生物素化方法提取细胞膜蛋白，分离、纯化，Western blotting法检测。所有操作步骤严格按照Pierce® Cell Surface Protein Isolation Kit试剂盒说明书进行[5]。主要步骤：①生物素化：收集待处理细胞，加入冰预冷的PBS溶液轻轻洗涤2次；加入冰预冷的生物素化溶液，4 ℃轻轻摇晃混匀，孵育30 min；生物素化标记结束，加入终止液终止反应。将细胞收集到离心管中，用冰预冷的TBS溶液洗涤细胞，3 000 r/min离心5 min，沉淀细胞；②细胞裂解：使用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上30 min裂解细胞，4 ℃ 10 000 g离心2 min，收集上清；③分离生物素化标记的膜蛋白：将NeutrAvidin琼脂糖珠子置于收集的上清中，加入蛋白裂解液，室温振荡，孵育60 min，1 000 g离心1 min，弃掉上清，wash buffer洗涤；④蛋白洗脱：将蛋白样品加入50 mmol/L DTT的SDS-PAGE 1×上样缓冲液，室温摇晃混匀，孵育60 min，1 000 g离心2 min，收集上清蛋白样品(即膜蛋白)，采用Western blotting法检测[5]。具体步骤：SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，4 ℃一抗(rabbit anti-hslo1 antibody，1∶1 000)孵育过夜，二抗(HRP tagged anti-rabbit antibody，1∶2 500)室温孵育1 h，ECL显影，采用Bio-Lab成像系统进行图像采集，所得图像采用Quantity One软件进行灰度值分析。

1.5 BKCa蛋白转运检测 采用流式细胞术。收集Control组、Rab5WT组、Rab5CA组和Rab5DN组转染后细胞，加入APC标记Flag一抗的荧光抗体(1∶400)，4 ℃孵育2 h。然后加入100 μL冰预冷的PBS重悬细胞，200目铜网过滤。另设置阴性对照(未转染的HEK293细胞)。使用流式细胞仪检测，通过计算得到Flag阳性细胞数与GFP阳性细胞数的比值，以此反映BKCa蛋白由细胞膜向质膜的转运。

2 结果

2.1 Rab5对BKCa电流的影响 与Control组比较，Rab5WT组、Rab5CA组BKCa电流明显增加，而Rab5DN组明显降低。结果见图1、表1。

注：全细胞构型下，膜电位(Vm)去极化到+60 mV时Rab5对BKCa全细胞电流的原始记录。

图1 Rab5对表达在HEK293细胞上的BKCa全细胞电流的影响

注：与Control组比较，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 Rab5对BKCa膜蛋白表达的影响 以Control组BKCa膜蛋白的相对表达量为1，Rab5WT组、Rab5CA组、Rab5DN组BKCa膜蛋白的相对表达量分别为1.24±0.08、1.42±0.13、0.73±0.11。与Control组比较，Rab5WT组、Rab5CA组BKCa膜蛋白的相对表达量明显升高，而Rab5DN组BKCa膜蛋白的相对表达量明显降低(P均<0.05)。

2.3 Rab5对BKCa蛋白转运的影响 见插页Ⅰ图1。未转染BKCa的HEK293细胞主要集中在第三象限，而Flag和GFP双阴性、转染BKCa(Flag-hSlo-GFP双标记)的HEK293细胞则分布在第一、三、四象限。其中第一象限为Flag和GFP双阳性细胞，即能够检测到BKCa蛋白在细胞膜上表达的细胞；第四象限为GFP阳性、Flag阴性细胞，即虽然转染BKCa通道，但由于大多数通道表达主要集中在细胞内，未被Flag抗体检测到。因此，分析Flag阳性与GFP阳性细胞的比值(即第一象限与第一、四象限之和的比值)，可反映BKCa蛋白的转运情况。Control组、Rab5WT组、Rab5CA组、Rab5DN组Flag+/GFP+分别为42.37±4.86、53.74±5.48、62.83±4.93、31.47±4.71。与Control组比较，Rab5WT组、Rab5CA组Flag+/GFP+均明显增加，而Rab5DN组明显降低(P<均0.05)。

3 讨论

BKCa在多种组织细胞中均有表达，在血管平滑肌细胞上分布极为丰富。在血管平滑肌细胞上，BKCa激活可引起细胞膜超极化，通过抑制L型钙通道而舒张血管[6,7]。BKCa同时还可偶联胞内钙和膜电位，在调控血管平滑肌功能中发挥重要作用。膜离子通道的功能很大程度上依赖于其在细胞膜上的表达丰度。有研究证实，多种心血管系统疾病与细胞膜离子通道的表达丰度改变密切相关；而离子通道在细胞膜上的表达一方面取决于通道蛋白通过靶向运输机制转运到细胞膜的数量，另一方面又受到膜上蛋白内吞循环途径的调控。我们前期研究发现，高血压患者细胞膜BKCa转运功能存在异常[2,8]。但目前对血管平滑肌细胞上BKCa功能的调控，尤其是通道蛋白转运机制尚不完全清楚。故阐明BKCa在血管平滑肌功能调控中的作用具有重要意义，且对其转运的调控还有可能成为临床心血管疾病治疗的靶点[9～11]。

小G蛋白因其分子量只有20～40 kD而得名，目前已经发现的Rab蛋白超过60种。Rab在细胞内多种细胞器中表达，包括内质网、高尔基体和细胞膜，从而参与蛋白质转运。Rab调节大部分胞内转运事件，在囊泡的定向运输中发挥重要作用。不同的Rab蛋白可能在不同的离子通道蛋白转运过程中作用不同；而同一Rab蛋白对不同离子通道的调控作用亦可能不同[4,12]。如离子通道CFTR从内质网向高尔基体的转运是一种不依赖Rab1/2，而是依赖COPⅡ的囊泡转运方式[13]；而Kv4.2/KChIP1从内质网向高尔基体的转运则是依赖Rab1和COPⅠ，而不依赖COPⅡ的转运途径[14]。Rab5作为在囊泡上表达十分丰富的小G蛋白，调控一些离子通道蛋白转运，包括通道蛋白经囊泡由细胞质转运到细胞膜的过程以及转运到细胞膜上的通道蛋白内吞进入细胞质的过程。既往研究发现，Rab5参与CFTR、GluT4、KCNQ1/KCNE1通道的内吞作用；而对于Kv1.5通道的内吞作用结果并不一致。McEwen等[15]研究发现，Kv1.5通道内吞与Rab5有关，通过采用表达Rab5显性负性(DN)的质粒，可明显抑制通道内吞而增加在细胞膜上的表达。但也有研究认为，Kv1.5的内化过程并不需要Rab5参与，而是以一种不依赖Rab5的含小窝蛋白的脂筏转运方式[16]。Sokolowski等[17]研究发现，小G蛋白Rab11b可与耳蜗细胞的BKCa共定位，使用Rab11b的siRNA可明显减少BKCa在细胞膜上的表达，进一步发现，Rab11b通过晚期包涵体发挥促进BKCa在细胞膜上表达的作用。但目前关于Rab5对BKCa蛋白转运调控的研究鲜见报道。

本研究在BKCa的胞外S1～S2环插入了Flag标签，利用Flag的荧光一抗检测BKCa蛋白在细胞膜上的表达水平，而在BKCa的胞内C端连接有GFP，其荧光强度能反映BKCa蛋白在细胞上整体的表达水平。李涛等[18]研究表明，Flag和GFP标签并不影响BKCa电流和在细胞膜上的表达。本研究结果显示，与Control组比较，Rab5WT组、Rab5CA组BKCa电流明显增加，而Rab5DN组明显降低；与Control组比较，Rab5WT组、Rab5CA组BKCa膜蛋白的相对表达量明显升高，而Rab5DN组明显降低；与Control组比较，Rab5WT组、Rab5CA组Flag+/GFP+明显增加，而Rab5DN组明显降低。这些结果均提示Rab5WT或Rab5CA促进了BKCa蛋白在细胞膜上的表达。

综上所述，Rab5可促进BKCa蛋白由细胞质向质膜的转运过程，从而增加BKCa蛋白在细胞膜上的表达丰度。Rab蛋白是一个大家族，但本研究仅关注了Rab5对BKCa蛋白的调控过程，其他Rab蛋白对于BKCa蛋白的转运调控及其对BKCa的功能调控尚需进一步研究。

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Effect of Rab5 on large-conductance Ca2+-actived K+channels (BKca) expressed in HEK293 Cells

ZHOUDan1,LIUXueru,LITao,LIULi,TANXiaoqiu,LIUYulin

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the effect of Rab5 on large-conductance Ca2+-activated K+channels (BKCachannels) expressed in HEK293 cells. Methods HEK293 cells in the logarithmic phase were randomly divided to four groups: the control group, Rab5WT group, Rab5CA group and Rab5DN group. HEK293 cells were transfected with Flag-hSlo-GFP plasmid in each group and with pcDNA3.1 for control group, Rab5WT for Rab5WT group, Rab5CA for Rab5CA group and Rab5DN for Rab5DN group, respectively. Total 4 μg plasmid with 1∶1 to each plasmid was transfected into 3.5 mm dish. Transfection rate was observed under fluorescence microscopy and the effect of Rab5 on BKCachannels was detected by patch clamp technique, Western blotting and flow cytometry when the trasfection rate was above 70%. Results Compared with the control group, Rab5 WT and Rab5 CA significantly increased BKCamacroscopic currents, while BKCacurrents were decreased in the Rab5DN group. Rab5 WT and Rab5 CA increased the expression of membranous BKCaprotein in HEK293 cells, while Rab5DN decreased the expression (allP<0.05). Rab5 WT and Rab5 CA increased the Flag+/GFP+ratio (allP<0.05), while Rab5DN decreased the ratio (P<0.05). Conclusion Rab5 significantly increases BKCacurrents and channel expression on cell surface and may promote the transport process of BKCacurrents to cell membrane in HEK293 cells.

small G protein family; large-conductance Ca2+-activated K+channels; protein transport; gene transfection

国家自然科学基金资助项目(31300948)。

周丹(1981-)，男，硕士研究生，研究方向为麻醉学。E-mail： dyzhoudan@163.com

刘玉林(1968-)，男，副教授，研究方向为麻醉学。E-mail： anesthesia2000@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.006

R331.3+6

A

1002-266X(2017)08-0021-04

2016-09-06)