外周和门静脉血中循环肿瘤细胞在胰腺癌诊治中的研究现状及应用前景

王洋，周家华

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学 附属中大医院，江苏 南京 210009)

外周和门静脉血中循环肿瘤细胞在胰腺癌诊治中的研究现状及应用前景

王洋1，周家华2

(1.东南大学 医学院，江苏 南京 210009； 2.东南大学 附属中大医院，江苏 南京 210009)

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，早期诊断率及5年生存率低。目前胰腺癌循环肿瘤细胞检测技术繁多，其灵敏度和特异性不尽相同，外周血和门静脉血中循环肿瘤细胞数量及标志物表达对胰腺癌的诊断、预后具有提示作用。本文作者对外周和门静脉血中循环肿瘤细胞在胰腺癌诊治中的研究现状作一综述。

循环肿瘤细胞; 胰腺癌; 门静脉血; 检测; 预后； 综述

目前胰腺癌(pancreatic carcinoma，PC)是恶性程度最高的肿瘤之一，在西方国家为第四大癌症相关的主要死亡原因，其5年生存率仅为1%～4%，中位生存期为4～6个月[1]。尽管对无淋巴结侵犯的胰腺癌患者行外科手术切除可使其5年生存率提高至20%～25%，但大多数患者就诊时已存在肝脏或腹腔转移。腹部增强CT、磁共振等影像学检查是目前唯一可行的诊断方法，但无法显示<5 mm的微小病灶或转移灶。肿瘤标志物包括CA19- 9、CEA等，其敏感性及特异性均有限[2]，仅具备一定参考价值。而近来出现的循环肿瘤DNA(ctDNA)、外泌体(exosome)等血清学指标仍处于实验阶段，尚未投入临床应用。目前胰腺癌的早期诊断在技术上难以实现，但对肿瘤细胞的早期发现将有利于减缓肿瘤进展及病灶转移，降低患者死亡率。大量研究[3- 6]证实,肿瘤细胞存在于胰腺癌患者的外周血及门脉系统中。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells， CTCs)是来源于原发肿瘤或转移灶、获得脱离细胞基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞，其在肿瘤复发和转移过程中的作用逐渐得到重视。随着细胞检测及鉴定技术的发展，对外周血及门静脉中CTCs的检测使胰腺癌的早期诊断、化疗效果评估及预后判断成为可能。现就近年来胰腺癌CTCs的检测技术、研究现状及应用前景进行综述。

1 CTCs检测技术

1.1 分离和富集

CTCs与循环血细胞相比数量极少，在10 ml外周血中可能仅存在1～2个，而在同样体积血液中存在107的白细胞和超过1010的红细胞。因此对CTCs的分离须过滤掉血液中其他细胞的干扰，特定地筛选出这些数量稀少的肿瘤细胞。

1.1.1 物理富集方法

物理富集方法是根据CTCs与血细胞间密度、直径等物理性质不同而进行分离的方法，目前最常用的物理富集方法为密度梯度离心法及滤过膜分离法。

1.1.1.1 密度梯度离心法 密度梯度离心法是一种较为传统的细胞富集技术，利用特定介质使不同密度的细胞在离心管内通过重力作用分层、分离，其常用介质为氯化铯、蔗糖等。CTCs较外周血单核细胞具有低密度特点，在此基础上建立的OncoQuick系统较常规方法增加了多孔屏障，能使分离出的目的细胞更加纯化，从而提高CTC的检出率[7]，但仍有特异性低的缺点。

1.1.1.2 滤过膜分离法 ISET以及ScreenCell®过滤装置根据细胞大小不同进行分拣，其滤孔直径在8.0 mm或以下，已能够从结肠癌、肝癌、软组织肉瘤、非小细胞肺癌等恶性肿瘤中的外周血中分离出CTCs[8- 11]。其优势在于能够快速分离活细胞或固定细胞，不依赖于上皮标志物，已被证实其灵敏度高于单纯利用上皮标志物抗体的检测方法。该技术成本低廉，且分离过程中能保持细胞完整性，避免对细胞形态的破坏而影响进一步的细胞培养、细胞形态学及分子生物学分析。但其缺点仍为特异性不足，易致CTCs丢失或白细胞混入。

1.1.2 生物富集方法

生物富集方法是根据CTCs和血细胞间生物标志物的差异进行分离的方法。免疫磁珠分离法是最常用的生物富集方法，其利用特异性的单克隆标记磁珠结合肿瘤细胞表面特异性抗原(通常为epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)进行细胞分选。唯一被FDA认证的CellSearch系统现已应用于转移性乳腺癌、结肠癌及前列腺癌的检测和治疗中，但对胰腺癌的检测应用较少。该技术受限于在外周循环中存在非肿瘤的上皮细胞[12]，这种现象甚至已经在健康受试者体内得到证实，并且上皮标志物通常在肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial- mesenchymal transition,EMT)过程中丢失，因此该法同样存在假阳性和假阴性的缺陷。

1.2 检测和鉴定

1.2.1 细胞计数

细胞计数法是根据细胞的抗原表达来分离和计数CTCs，大多使用抗上皮特异性抗原的抗体。其优点在于保证了CTCs完整性，能进一步分析其细胞形态学和分子学特征，而缺点在于缺乏肿瘤特异性抗体。

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是通过单克隆抗体对肿瘤细胞特异性标志物的识别实现分选和计数，并且该技术可同时检测CTCs多种生物学特性，包括细胞内DNA含量、细胞活力以及细胞内或表面特异标志物等，但其缺点是灵敏度偏低。Catenacci等[13- 14]使用FACS(fluorescence activated cell sorting)系统成功将胰十二指肠切除术中采集的门静脉CTCs进行计数，证实其数量多于同时采集的外周血中CTCs。

1.2.2 免疫荧光染色

免疫荧光染色基于肿瘤相关抗原或特异性标志物与单克隆抗体结合,通过显色反应来判断目的细胞特性，常用标志物有EpCAM、CK、CA19- 9等。使用双重免疫荧光染色还能够证明两种标志物在同一细胞中表达，并对其定位加以区分。该检测方法较为简便，且敏感性和特异性较高。但在一些良性上皮增殖性疾病、手术、炎症和组织创伤等情况下，部分上皮细胞可进入外周血，这些细胞表面存在同样的特异性抗原，易致假阳性发生；同时，在发生EMT过程中，部分CTCs表面特异性标志物表达减弱甚至丢失，导致假阴性的发生。Poruk等[15]通过对46例PDAC患者外周血CTCs的CK、Vimentin及CD45进行染色，将其分为上皮样CTCs和间质样CTCs，得出两者数量分别与肿瘤总体生存期(overall survival,OS)及早期复发有关。基于该技术改进的iFish(immunostaining- fluorescence in situ hybridization)染色在胰腺癌、胃癌中也得到应用[16- 17]。

1.2.3 核酸检测

逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptase- polymerase chain reaction,RT- PCR)检测肿瘤的过表达或突变基因的mRNA，相对于复杂的DNA检测是一种很好的替代方法。肿瘤细胞死亡后，RNA在血液中快速降解，对其检测可以代表肿瘤细胞的完整特性，而细胞碎片或游离RNA则不具备这一优势。RT- PCR采用荧光探针与扩增序列特定寡核酸序列相结合，从而使扩增时出现假阳性的可能最小化，并可以同时对多种突变进行定量检测。相对于免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)来说，该方法更为客观，并且更易实现自动化，RT- qPCR已逐渐应用于胰腺癌CTCs检测中[18- 19]。

1.2.4 微流体芯片

微流体芯片技术(CTC- chip)是基于微流体学和免疫学的CTCs检测技术，由Nagrath等[20]首先报道。芯片表层包被EpCAM抗体，当外周血样本通过芯片时，EpCAM+细胞附着于微流体柱表面。通常将CK(cytokeratin)和DAPI(4′,6- diamidino- 2- phenylindole)作为阳性分选，CD45作为阴性分选，因此其敏感性和特异性均非常高。在其基础上改进的人字形芯片(herringbone- chip，HBChip)，增加了目的细胞和芯片的交互数量，可以处理更大容量血液样本，提高了肿瘤细胞的分离效率。Wen等[21]利用CMx系统将胰十二指肠切除术中采集的门静脉血中符合panCK+/CD45-/DAPI+条件的细胞筛选出，并得出其数量与肿瘤肝转移密切相关。

2 CTCs在胰腺癌中的应用

2.1 CTCs与胰腺癌诊断

CTCs作为生物标志物在胰腺癌中的作用与其他实体瘤中相似，其在外周血中数量稀少，大量肿瘤晚期患者检测率仍偏低，而鲜有文献报道其检测假阳性，因此检测特异性明显优于敏感性。但如前所述，目前检测方法繁多，对CTCs细胞定义也不尽相同，使得各方法间很难比较。

CTCs对于胰腺癌的诊断价值，各研究结论不一。Allard等[12]利用CellSearch系统在16例PDAC患者外周血中6例检测出CTCs(37.5%)。Rhim等[22]使用GEM- chip法对32例胰腺病变患者外周血进行检测，在11例PC患者中8例检测出CTCs(73%)，21例囊性病变患者中7例检测出CTCs(33%)，而在19例健康对照者中均未检测出CTCs。Poruk等[15]利用ISET系统在44例可切除PDAC患者中40例检测出CTCs(90%)，得到间质样CTCs与患者术后短期复发相关(P=0.043)。Yang等[16]利用密度梯度离心及iFish法在25例PDAC患者中检测出103个CTC细胞，而其数量与肿瘤分期及CA19- 9水平并无关联。

CTCs对胰腺癌的诊断阳性率仍明显低于超声内镜穿刺(endoscopic ultrasonography- fine needle aspiration,EUS- FNA)，但其特异度普遍在95%以上，与内镜取得活检病理结果相一致，进一步行分子生物学研究可提高其诊断准确性，并且其在费用以及安全性方面明显优于超声内镜。因此,CTCs检测可作为潜在的辅助检查手段，在将来投入临床应用。

2.2 CTCs与胰腺癌预后

现有众多证据表明，CTCs的存在提示胰腺癌患者较差的预后。Kurihara等[23]利用CellSearch法在26例PC患者中11例检测出CTCs(42%)，这部分患者具有较短的总体生存期(P<0.001)。Poruk等[15]利用ISET系统在44例可切除PDAC患者中40例检测出CTCs(90%)，得到上皮样CTCs与患者预后相关(P=0.008)。Yang等[16]利用密度梯度离心及iFish法在25例PDAC患者中检测出103个CTCs，而CTC≥3·(7.5 ml)-1提示肿瘤较差预后(P=0.037)。

尽管有研究得出CTCs数量与胰腺癌预后无显著性关联，但结果仍提示存在这一趋势，若将其较少样本量纳入考虑，则该结论的可信度将有所增加，因此仍须进行大样本研究及长期跟踪随访来提高其准确性。

2.3 CTCs与门静脉系统

Jiao等[24]利用CellSearch系统对29例结直肠癌肝转移患者肝切除术中获取的7.5 ml门静脉血CTCs进行计数，发现其中位数[87·(7.5 ml)-1]多于同时采集的外周静脉血[1·(7.5 ml)-1]。Catenacci等[13]最近利用超声内镜及细针穿刺对18例胰腺胆管癌(PBCs)患者门静脉血CTCs进行获取和计数，同样发现其中位数[111.8·(7.5 ml)-1]显著多于同时采集的外周血[0.7·(7.5 ml)-1]，且在不可切除PBCs患者中数量多于可切除PBCs患者。

肝脏对消化道肿瘤CTCs具有过滤作用，使CTCs进入全身循环的数量明显减少，其机制类似于肝脏对药物的“首过消除”效应。胰十二指肠切除术中收集的门静脉血CTCs数量与术后肝转移相关，其阳性预测值达到84.6%，阴性预测值达到87.2%[21]，而外周血中CTCs的低检测率限制了其提示作用。这一结论对门静脉血高水平CTCs患者术后进行辅助治疗具有指导意义。近来有学者尝试将转移起始细胞(metastasis- initiating cells,MICs)作为预后指标，然而其仅存在于具有高水平CTCs数量的血液中，于单个血液样本中难以捕获，且缺少特异性标志物，因此并没有实际应用意义[21]。

Arnoletti等[14]对21例PDAC患者术前及术后外周血、术中肿瘤切除前后门静脉血中CTCs性质进行比较，发现门静脉血CTCs具有更高水平K- RASmutmRNA转录以及组蛋白乙酰化水平，且在肿瘤切除后进一步升高，预示着肿瘤切除后CTCs仍具有一定转录活性，且可以被M- MDSC(myeloid- derived suppressor cells with immature monocytic nature)所诱导的免疫抑制环境所增强。而在门静脉血中CTCs数量也与M- MDSC水平密切相关，提示门静脉的免疫抑制微环境对CTCs的免疫逃逸具有促进作用。门静脉系统中存在的涡流对其内肿瘤细胞具有滞留作用，增加细胞和细胞间、细胞和血管间物质交换，促进肿瘤细胞活化和其在局部组织中的驻留。这也解释了门静脉相对于外周血中CTCs的特殊性。

在胰腺癌手术当中对门静脉血的获取将有利于检测其中活化且具有转移潜能的肿瘤细胞，而这项技术也将随着超声内镜的应用得到进一步推广。

3 结 语

就目前胰腺癌的早期诊断和转移监测而言，CTCs(尤其门静脉CTCs)具有重要意义，利用循环血CTC实时检测来代替肿瘤组织活检，将能极大程度改善患者治疗的适应性及减少创伤，避免不必要的有创性检查及过度治疗。此外，有研究证实CTCs可通过一种“肿瘤自身种植”机制完全复制原发肿瘤的特性，在浸润血管中自由出入，即能够从血液中重新返回原位灶继续生长引起肿瘤复发，并促进血管形成及基质募集[25]。而在部分PDAC癌前病变模型中，CTC检测可在肿瘤形成之前即呈现阳性，因此其释放入血可认为是发生在肿瘤形成中的早期事件，这也支持了CTCs检测能够用于监测胰腺癌进展的观点。进一步行癌细胞特异性基因突变研究，在未来可能实现以CTCs为目标的靶向治疗。相较乳腺癌、肺癌、结肠癌等其他上皮肿瘤来说，胰腺癌仍然缺乏特异性足够高的肿瘤标志物，且CTCs检测率相对较低，检测成本相对较高，目前尚缺少大规模、前瞻性研究来指导其临床应用。胰腺癌术中采集的门静脉血CTCs相较外周血检测率明显升高，且对胰腺癌转移具有提示作用，在超声内镜进一步推广后其安全性及实用性将大为提高。

总而言之，作为新兴的“液体活检”项目，CTCs检测对于肿瘤的无创实时监测、个体化治疗或将大有助益，个体化用药也将更多依赖于CTCs而非肿瘤活检组织的细胞学及分子生物学分析。

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2017- 01- 27

2017- 05- 20

江苏省重点研发计划项目(7790000085)

王洋(1991-)，男，江苏南京人，在读硕士研究生。E- mail:840238489@qq.com

周家华 E- mail:zhoujh@seu.edu.cn

王洋,周家华.外周和门静脉血中循环肿瘤细胞在胰腺癌诊治中的研究现状及应用前景[J].东南大学学报：医学版，2017，36(4)：673- 677.

R44; R735.9

A

1671- 6264(2017)04- 0673- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.037