1，25-二羟维生素D3对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化调节性T细胞的作用研究〔1〕

王建吴，罗静，郭珲

(山西医科大学第二医院，山西 太原 030001)

1，25-二羟维生素D3对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化调节性T细胞的作用研究〔1〕

王建吴，罗静，郭珲*

(山西医科大学第二医院，山西 太原 030001)

目的：探讨1，25-二羟维生素D3[1，25(OH)2D3]对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾间质纤维化调节性T细胞(Treg)的作用。方法：54 只健康雄性wistar大鼠随机分为假手术组(A组)、UUO组(B组)、1，25(OH)2D3治疗组(C组)。每组于术后第1天、第3天、第7天分批处死6 只，留取肾脏组织。用HE染色观察肾脏病理变化，采用免疫组织化学染色法测定肾脏人叉头框蛋白P3(FOXP3)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。结果：与假手术组相比，UUO组FOXP3表达水平显著降低，α-SMA表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与UUO组相比，1，25(OH)2D3治疗组FOXP3表达水平显著升高，α-SMA表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：调节性T细胞可能参与了肾间质纤维化的发生及发展；1，25(OH)2D3作为免疫调节剂可通过上调调节性T细胞减缓肾脏纤维化的进展。

1，25-二羟维生素D3；肾脏间质纤维化；调节性T细胞

肾间质纤维化是所有慢性肾脏病(CKD)，包括原发性、继发性肾小球疾病，肾小管间质和血管疾病以及肾移植慢性排斥性病变发展至终末期肾脏病(ESRD)共同的最终结局，病理特点包括细胞外基质增多、炎症细胞在间质沉积、肾小管扩张或萎缩、细胞凋亡等，其确切的发病机制尚未完全清楚，目前治疗效果不理想。炎症是慢性肾脏疾病的基本病理改变，也是肾纤维化的启动因素，主要表现为免疫细胞浸润和分泌炎性介质。调节性T细胞(Treg)是一种免疫细胞，胞质内特异性的表达人叉头框蛋白P3(FOXP3)转录因子[1]，因此FOXP3在一定程度上可反映Treg细胞的水平和活性。多项研究证实，Treg细胞紊乱参与了肝脏及肺脏纤维化的进展[2-4]。Treg细胞是否参与肾脏间质纤维化的发生及发展，国内外研究较少。

1，25-二羟维生素D3是维生素D3的活性形式，通过与特异性维生素D受体(VDR)结合而发挥免疫调节作用[5]。维生素D受体主要存在于T细胞、B细胞、树突状细胞及巨噬细胞中[6]，1，25-二羟维生素D3主要参与耐受性树突状细胞成熟、Treg细胞的分化及促进免疫抑制反应的细胞因子的分泌进而抑制反应性T细胞的免疫应答[7]。1，25-二羟维生素D3是否通过上调Treg细胞减缓肾间质纤维化的进展，国内外研究较少。本研究主要探讨单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型中Treg细胞的变化及1，25-二羟维生素D3对其的影响，从而阐述1，25-二羟维生素D3是否可通过上调Treg细胞减缓肾间质纤维化的进展。

1 材料与方法

1.1 研究的主要试剂和仪器

叉头蛋白P3抗体(北京博奥森公司)、抗α-SMA抗体(Abcam公司)、羊抗兔IgG抗体(北京博奥森公司)、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(北京博奥森公司)、DAB显色液(北京中杉金桥公司)、1，25(OH)2D3(罗盖全，上海罗氏公司)、荧光显微镜(Nikon公司)。

1.2 研究对象及分组

健康清洁级wistar大鼠54 只，由山西医科大学动物实验中心提供，体重为190～210 g，平均(200±10) g。将所有wistar大鼠随机分成3 组，分别为假手术组(A组)、UUO组(B组)、1，25(OH)2D3治疗组(C组)，每组各18 只，三组均于术后第1天、第3天、第7天分批处死6 只，留取手术侧的肾组织。

1.3 实验方法

1.3.1 UUO模型制备

将B组及C组健康雄性wistar大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)经腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上，剪毛并消毒腹部皮肤，行左侧耻骨上切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层，暴露并分离左侧输尿管，沿左肾下极寻找到左输尿管，于中上1/3处用4号线上下结扎两处，然后从中剪断输尿管。A组大鼠输尿管不予结扎，麻醉及其余手术步骤同UUO模型组。

1.3.2 给药剂量

C组给予1，25(OH)2D33 ng/100 g，A组及B组给予花生油0.5 mL，均于每日上午灌胃，实验期间各组正常饮食生活。

1.3.3 组织标本灌注及取材

用浓度为10%水合氯醛经腹腔注射麻醉大鼠后，打开胸腔，将灌注用针经心尖部进入左心室，然后剪开右心耳，迅速推入生理盐水，心耳处流出无色澄清液体后停止灌注。剪开腹腔，取出手术侧肾脏组织。

1.3.4 肾组织形态学观察

常规石蜡切片，HE染色，观察肾脏组织改变。

1.3.5 肾脏组织FOXP3蛋白、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的检测

取肾组织标本，采用免疫组织化学方法检测。4 μm厚石蜡切片脱蜡水化后，用体积分数3%过氧化氢溶液处理内源性过氧化氢酶，微波修复(EDTA缓冲液)，3%BSA封闭液封闭40 min，分别滴加FOXP3抗体(稀释300倍)、抗α-SMA抗体(稀释200倍)，37 ℃孵化2 h。PBS缓冲液清洗3次，每次5 min，加入二抗(稀释200倍)，37 ℃孵化30 min，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作阴性对照。以FOXP3蛋白在肾小管上皮细胞染成黄色或棕黄色为阳性。采用荧光显微镜(200倍)观察采集图像。每个切片随机测定5个视野，应用Image Pro Plus6.0图像分析软件测量每一视野中阳性染色区域的积分光密度值(IOD)与测量区域的面积(Area)，计算平均光密度，平均光密度=IOD/Area，对免疫组织化学染色进行半定量分析。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 肾组织形态学表现

光镜下观察，HE染色A组未见明显异常。B组术后第1天和第3天肾小管轻度扩张，上皮细胞空泡变性，肾间质宽度增加，间质中少量炎症细胞浸润；第7天肾小管扩张明显，上皮细胞出现变性、水肿、甚至坏死，肾间质可见大量炎性细胞浸润，间质宽度明显增加，偶见萎缩肾小管，纤维化较明显，表明UUO模型造模成功。

2.2 各组大鼠肾组织α-SMA、FOXP3表达情况比较

与A组比较，B组肾组织α-SMA表达水平显著升高，FOXP3表达水平显著降低，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。B组随着梗阻时间延长，FOXP3表达水平显著降低，α-SMA表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较，C组肾组织α-SMA表达水平显著降低，FOXP3表达水平显著升高，两组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(见表1、表2)。

表1 各组大鼠肾组织中α-SMA表达量

表2 各组大鼠肾组织中FOXP3表达量

3 讨 论

慢性肾脏病是各种原因引起的肾脏结构和功能障碍，近年来慢性肾脏病的患病率有明显上升趋势，每年达7%以上[8]。肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病进展为终末期肾衰竭的最终共同通路，且肾间质纤维化程度与肾功能减退关系较密切。单侧输尿管梗阻模型是以进行性肾小管间质纤维化为特征的实验性肾脏病模型，是公认的肾小管间质纤维化模型。在多种细胞因子作用下，肾间质成纤维细胞大量增殖并活化为肌成纤维细胞，表达平滑肌肌动蛋白和细胞外基质(如FN、各型胶原)，导致肾间质纤维化。α-SMA是肌成纤维细胞标志性蛋白[9]。尚无有效方法抑制肾间质纤维化的进展。

研究表明，Treg细胞具有介导自身免疫耐受与维持免疫平衡，对自身反应T淋巴细胞活化和增值起负调控作用。Treg细胞的功能失调与自身免疫性疾病、炎症反应、急性及慢性传染性疾病、肿瘤免疫耐受、移植排斥以及过敏性疾病密切相关[10-11]。Claassen等[2]研究揭示，在丙型肝炎病毒造成的肝纤维化中，Treg细胞的数量越多，肝纤维化的程度越轻，提示Treg细胞可抑制肝纤维化的发展。Kotsianidis等[3-4]研究表明，通过上调大鼠Treg细胞，可抑制肺纤维化的进展。我们的研究结果显示：与假手术组相比，UUO组肾组织FOXP3表达减少，α-SMA表达增加；随着梗阻时间延长，UUO组内肾组织FOXP3表达减少，α-SMA表达增加，提示肾间质纤维化中存在Treg细胞的紊乱，其减少可能加重肾间质纤维化的进展。

1，25-二羟维生素D3是维生素D3的活性形式，通过与单核细胞，活化的T、B细胞上的维生素D受体特异性结合而发挥免疫调节作用[5-6]。Jeffery等[12]研究证实，1，25-二羟维生素D3可诱导Foxp3高表达。Taal和Brenner[13]证实慢性肾脏病中1，25-二羟维生素D3水平下降，诱导RAS系统激活，进而加重肾脏纤维化。本研究结果显示：与UUO组相比，1，25-二羟维生素D3治疗组肾组织FOXP3表达增加，α-SMA表达减少，提示1，25-二羟维生素D3可通过上调Treg细胞减缓肾间质纤维化的进展，可能机制：诱导树突状细胞吲哚胺2，3二氧酶(IDO)的表达来上调Treg细胞的数量增加[14]；诱导Treg细胞表达CTLA-4、IL-10、TGF-β、Foxp3及CTLA-4[15]；促进树突状细胞表达趋化因子CCL17和CCL20而抑制归巢因子CCL22的表达，使Treg细胞招募至病变部位[16]。

综上所述，在UUO大鼠肾间质纤维化中存在Treg细胞的紊乱，且Treg细胞可能参与肾间质纤维化的发生及发展，1，25-二羟维生素D3可能通过上调Treg细胞减缓肾间质纤维化的进展，但对于1，25-二羟维生素D3通过何种途径发挥上述作用，还有待进一步研究。

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Effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on Treg cells in UUO rats with renal interstitial fibrosis

WANG Jianwu，LUO Jing，GUO Hui

(The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective：To explore the effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3on regulatory T cells in unilateral ureteral obstruction(UUO) rats with renal interstitial fibrosis.Methods：Fifty-four Wistar rats were assigned to healthy control group(A group)，UUO group(B group)，and 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group(C group).After surgery for 1 day，3 days and 7 days，6 rats were selected from every group randomly，and killed to get the renal.Renal pathological changes were observed by HE staining.The level of Forkhead Box ProteinP3(Foxp3) protein and alpha smooth muscle-actin (a-SMA) were assayed by immunohistochemistry.Results：Compared with healthy control group，the level of Foxp3 protein was significantly lower，and the expression of a-SMA protein was significantly higher in UUO group (P<0.05).Compared with UUO group，the level of Foxp3 protein was significantly higher，and the expression of a-SMA protein was significantly lower in 1，25-dihydroxyvitamin D3treatment group group (P<0.05).Conclusion：Treg cells may involve in the progress of the renal interstitial fibrosis.As an immunomodulator，1，25-dihydroxyvitamin D3might inhibit the progress of renal interstitial fibrosis through increasing the level of Treg cells.

1，25-dihydroxyvitamin D3；renal interstitial fibrosis；regulatory T cells

1671-8631(2017)03-0213-04

〔1〕本课题为山西省留学人员管理委员会办公室科研资助项目(课题编号：2013-117)；山西省国际科技合作项目(课题编号：2013081056)

*本文通讯作者：郭珲

R692.2

A

2016-12-17

(本文编辑：张荣梅)

王建吴(1991— )，男，山东省临清市人，在读硕士。研究方向：肾脏病学。