消化道肿瘤中的肝细胞生长因子受体信号靶向治疗研究进展

缪 鑫, 刘 政

南京医科大学第二临床医学院&南京医科大学第二附属医院消化医学中心, 江苏 南京 210000

专题

消化道肿瘤中的肝细胞生长因子受体信号靶向治疗研究进展

缪 鑫, 刘 政

南京医科大学第二临床医学院&南京医科大学第二附属医院消化医学中心, 江苏 南京 210000

肝细胞生长因子受体(c-Met)信号在促进肿瘤细胞增殖、转移、侵袭和肿瘤血管生成中扮演重要的角色。多种消化系统肿瘤被证实与c-Met的异常表达相关。c-Met靶向治疗成为抗肿瘤治疗中的一大热点，但 c-Met抑制剂耐药性普遍存在，其分子机制包括c-Met本身或下游信号蛋白的基因突变、其他膜受体信号的旁路补偿机制、中性粒细胞c-Met信号的非特异性抑制。随着生物技术的进步，抗体-药物偶联物、双特异性抗体及CAR-T细胞治疗逐渐成为肿瘤靶向治疗的新手段。本文对消化道肿瘤靶向治疗中的c-Met信号通路、c-Met抑制剂、c-Met抑制剂耐药性及靶向治疗的新手段作一概述。

消化道肿瘤; c-Met; 靶向治疗; 耐药性; 抗体药物偶联物; 双特异性抗体; CAR-T细胞治疗

近年来消化道肿瘤发病率呈逐年上升的趋势，手术、化疗、放疗三大治疗手段已不断地改进和更新，但对于晚期肿瘤的疗效仍不容乐观。随着分子生物学、基因组学、蛋白组学的不断进步，分子靶向治疗成为一种新型的治疗手段，其能特异性地阻断肿瘤细胞的信号传导而杀伤肿瘤细胞，并在临床上取得一定的疗效。目前研究[1-2]证实：食管癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、结肠癌等多种消化道肿瘤均有c-Met表达，且c-Met的激活与肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭、抗凋亡、转移、血管生成关系密切。靶向作用于c-Met信号通路成为消化道肿瘤治疗的又一选择方案。

1 肝细胞生长因子受体(c-Met)信号通路

c-Met蛋白是c-Met原癌基因编码的肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)的络氨酸激酶受体，由α亚基和β亚基通过二硫键相连的具有自身磷酸化活性的跨膜受体，包括3个部分：(1)50 KD的α亚基和145 KD的β亚基N端构成的胞外结合位点，其主要配体HGF与c-Met激活后引起癌细胞的自身磷酸化和增殖；(2)跨膜蛋白；(3)β亚单位C 端构成的胞内激酶区，HGF与c-Met的结合促进c-Met蛋白二聚作用和激活，诱导受体尾端的络氨酸残基磷酸化，招募GAB1(生长因子受体结合蛋白-1)、GAB2(生长因子受体结合蛋白-2)等细胞信号间质蛋白，引发多种底物蛋白磷酸化，由此激活PI3K、RAC1、STAT3、NF-κB等通路[3]。另外，这些通路发出的信号到达细胞核控制基因的转录和DNA的复制，在胚胎发育和组织修复过程中可促进细胞变性、增殖、抗凋亡、运动，而异常的c-Met 信号激活可致肿瘤细胞从肿瘤块中分解，侵蚀基底膜，渗透基质层，并最终形成新的转移灶，从而影响肿瘤发生、发展的多个环节[4]。目前研究[5]证实HGF并非c-Met的唯一配体，肝癌患者中脱γ羟基凝血酶原(DCP)同样可激活c-Met信号通路引发肿瘤细胞增殖。

2 c-Met信号通路在消化道肿瘤中的表达和意义

陈俊忠等[6]通过免疫组织化学染色法检测胃癌组织、癌旁组织、良性病变组织和癌前病变中的c-Met表达，结果显示胃癌组织中c-Met表达的阳性率显著高于其他组织，说明c-Met的表达有助于鉴别胃组织的良恶性病变；同时对胃癌的不同组织分型进行检测，c-Met表达的阳性率分别为低分化腺癌100%、黏液腺85.7%、癌腺癌60%，提示c-Met的表达可能与胃癌的恶性程度相关。Xu等[1]在2007年1月-2012年12月收集的180份食管癌术后标本，用免疫组织化学检测c-Met、表皮生长因子受体(EGFR)和人类表皮生长因子受体-2(HER2)的表达情况，并对这些食管癌患者进行术后随访46.2个月，结果显示，c-Met的高表达患者与c-Met阴性或低表达患者的生存率有显著差异，且c-Met的高表达是食管癌患者总体生存率的唯一预后因素。

3 c-Met信号通路的靶向治疗

2003年，c-Met激酶的晶体结构和c-Met的抑制剂首次被报道，随着对配体、受体结构功能相互关系理解的深入，同时c-Met抑制剂生产发展有很大提升，到2011年已有多种抑制剂进行临床试验[7]。目前，针对靶向作用于c-Met信号通路抑制剂主要包括3大类。

3.1 靶向作用于HGF 或HGF激活蛋白(HGFA) HGFA是一种能将HGF转化为活性形式的丝氨酸蛋白酶，Shia等[8]发现内源性的HGFA抑制剂1(HAI-1)的N端结构域可与HGFA活性结构域结合，阻断HGF/c-Met信号通路的激活。Wu等[9]证实HGF的抗体可阻断肿瘤细胞株的生长，动物实验中发现肿瘤的生长显著延迟。HGF的单克隆抗体Rilotumumab联合抗血管生成抑制剂贝伐单抗(Bevacizumab)治疗的进展期实体瘤的一期临床试验中未发现严重毒副反应，患者耐受良好[10]。Rilotumumab或安慰剂联合化疗药物表柔比星/顺铂/卡培他滨(ECX)治疗胃癌或食管胃交界性癌二期临床试验显示，试验组可显著改善无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的发展趋势。目前，c-Met阳性胃和食管胃交界处癌患者Rilotumumab联合ECX治疗方案的三期临床研究正在进行中[11]。

3.2 c-Met单克隆抗体 c-Met单克隆抗体直接与c-Met结合，竞争性地与配体结合，从而阻止下游信号通路传导。2013年，我们报道了自主生产的人源抗c-Met Fab抗体：以Met-Fc融合蛋白为抗原对大容量人源Fab抗体库进行固相筛选，将能够与c-Met-Fc结合的噬菌体抗体转染大肠杆菌，经5轮筛选后随机挑选30个克隆，然后进行酶联免疫吸附法差减鉴定，最终筛选出了一株抗c-Met抗体，并通过免疫共沉淀、荧光激活细胞分类术、免疫荧光等多种方法证实它与人肝癌细胞表面c-Met分子结合[12]。Jin等[13]利用HGF诱导胰腺癌BxPC-3和 KP4细胞株的细胞增殖， 加入c-Met单抗后，两种细胞株细胞增殖显著被抑制，且c-Met和接头蛋白Gab-1的磷酸化程度明显降低，他们在之后的胰腺肿瘤模型小鼠实验中发现，c-Met单抗治疗可以抑制肿瘤的生长、提高小鼠生存期。Salgia等[14]首次评估了c-Met单抗(Onartuzumab)在人体临床研究中的安全性、免疫原性、药代动力学和抗肿瘤作用，证实实体恶性肿瘤的患者接受Onartuzumab单药治疗或与贝伐单抗的联合治疗普遍耐受良好。

3.3 c-Met络氨酸激酶抑制剂 根据小分子抑制剂的化学结构及与c-Met结合的部位和模式，c-Met抑制剂可以分为两大类。Ⅰ类抑制剂与ATP结构相似，竞争性结合于ATP结合位点，对c-Met具有高度的选择性[15]，其中，Tivantinib是目前已运用于临床试验，Santoro等[16]建议Tivantinib作为二线药物治疗晚期肝癌，尤其适用于肿瘤组织c-Met阳性表达的患者，临床试验中发现的不良反应值得重视，Tivantinib(360 mg bid)组患者中性粒细胞减少症发生率高达21%，而Tivantinib (240 mg, bid)组仅有8%，建议在Ⅲ期临床试验的Tivantinib用量均为240 mg, bid。Ⅱ类抑制剂的结构更加舒展，除了竞争性结合ATP结合位点，还能结合非活性激酶的DFG-out变构结合位点，其中，DFG-out变构结合位点位于非活性激酶ATP结合位点相邻的位置，此类抑制剂能与多种络氨酸激酶受体相结合。目前，运用到临床试验的Ⅱ类抑制剂种类较多，如E7050、AMG-458、ARQ197、XL184、GSK1363089等。Shah等[17]通过X线晶体衍射技术证实，GSK1363089与c-Met相互结合时能够同时占据ATP结合位点及其紧邻的位点，两者结合紧密且有更长的分解半衰期。激酶抑制实验发现GSK1363089同时对血小板生成因子1(Flt-1)、血小板生成因子4(Flt-4)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)等其他激酶具有抑制作用。在体内实验中，将B16F10 细胞尾静脉注入小鼠体内，3 d后予GSK1363089 (30、100 mg·d-1·kg-1)灌胃给药，发现实验组的肺转移明显抑制，且这种抑制作用具有剂量依赖性。

4 c-Met抑制剂的耐药

靶向作用于c-Met的抗肿瘤治疗已取得一定疗效，但其耐药性存在成为抗肿瘤治疗的瓶颈，克服和防止耐药性是提升治疗潜力的一大关键。Qi等[18]通过体内外模型发现相关基因突变及旁路机制促进耐药的产生。结构分析显示c-Met活化环突变使c-Met自动抑制的空间构象不稳定，且能够中止抑制剂与c-Met之间芳香堆积相互作用。他们同时发现转化因子α的高表达导致EGFR的激活，EGFR高表达可以避开c-Met信号直接激活肿瘤细胞的下游通路，从而逃避了c-Met抑制剂的作用。Pennacchietti等[19]指出，目前靶向药物的筛查仅基于细胞层次的研究，既往研究证实，MET基因扩增的肿瘤对c-Met的靶向药物敏感，但是忽略了肿瘤微环境中大量存在的HGF。利用c-Met单抗敏感肿瘤细胞株与HGF组成基质-肿瘤共培养系统，证实HGF可以促进c-Met靶向药物的耐药，其机制主要是通过生理性GAB1介导的PI3K活化来补偿失活的HER3依赖的PI3K信号。在体内实验中，考虑到联合免疫缺陷(SCID)小鼠的HGF无法激活人源的c-Met，改用人源性HGF基因嵌入技术使SCID小鼠只表达人源性的HGF，每周2次腹腔注入HGF中和抗体Ficlatuzumab后发现，在野生型SCID小鼠中c-Met抑制剂可显著抑制肿瘤的生长(84%的抑制率)，但仅部分抑制人源性HGF基因嵌入型SCID小鼠的肿瘤生长(49%的抑制率)，Ficlatuzumab联合c-Met抑制剂可显著抑制人源性HGF嵌入型小鼠肿瘤的生长(83%的抑制率)。c-Met不仅在肿瘤细胞中表达，同时表达于各种免疫细胞。Finisguerra等[20]发现在肿瘤微环境中表达c-Met的中性粒细胞可以招募抗肿瘤性中性粒细胞，抑制肿瘤的生长和转移,证实经过全身的c-Met抑制剂给药后，中性粒细胞c-Met的阻断降低了中性粒细胞一氧化氮(NO)释放引起的肿瘤杀伤作用，同时减少了抗肿瘤中性粒细胞的招募，是c-Met靶向治疗的潜在弱点，也是c-Met抑制剂耐药的原因。因此，目前涌现出各种靶向治疗的新手段越来越受到关注。

5 c-Met靶向治疗的新手段

5.1 抗体-药物偶联物 抗体-药物偶联物即将抗体分子与细胞毒物连接的导向药物，以高效识别肿瘤特异性抗原的单克隆抗体作为载体，以细胞毒药物作为弹头，同时具备了高特异性和高毒性的双重特征，有利于克服单克隆抗体肿瘤治疗的耐药性。我们曾报道使用基因工程技术将扩增的c-Met单链基因和绿脓杆菌外毒素活性片段(PE38KDEL)基因克隆入表达载体中，成功表达重组的抗c-Met/PE38KDEL偶联蛋白分子。纯化的抗c-Met/PE38KDEL能够特异性结合c-Met的阳性肝癌细胞系细胞，并证明其能通过Caspase-3/8信号介导肝癌细胞株的增殖缺陷。体内实验中，在裸鼠皮下注射SMMC-7721肝癌细胞株，肿瘤生长至50～70 mm3后，予以静脉注射抗c-Met/PE38KDEL 14 d后，当抗体-药物偶联物浓度为2 mg/kg，肿瘤生长和体质量受到显著抑制。细胞增殖和凋亡相关的核抗原Ki-67蛋白免疫组化检查显示，抗c-Met/PE38KDEL浓度为2 mg/kg的小鼠肿瘤组织的Ki-67的表达量显著下降，证实抗c-Met/PE38KDEL通过增殖和凋亡两条途径对小鼠肿瘤细胞产生抗肿瘤影响作用[12]。另外，抗体偶联药物抗c-Met/PE38KDEL同样对胃癌细胞株MKN-45 和SGC7901的细胞生长和蛋白合成有显著抑制作用，并呈时间和剂量依赖性[21]。

5.2 双特异性抗体 双特异性抗体具有两种不同抗原结合特异性，扩展了基于抗体治疗的应用范围，如：双特异性抗体可以促进肿瘤组织周围的细胞毒性T细胞的招募，同时抑制两条信号通路，而且可作为一种输送方式使抗体能够穿过血脑屏障[22]。Spiess等[22]利用能够表达凸状和凹状结构半抗体两种大肠埃希菌，将两者混合接种摇瓶共培养、增殖、诱导抗体表达、裂解和纯化，最终成功研制出更易紧密结合的c-Met和EGFR的双特异性抗体，并在小鼠体内实验中证实这种双特异性抗体能同时阻断c-Met和EGFR通路。 Castoldi等[23]发现，将c-Met和EGFR靶向药物化学计量比值设定为1∶2情况下，双特异性抗体可显著降低HGF或EGF诱导的肿瘤侵袭性生长。双特异性抗体在低剂量(10 nmol/L)情况下可有效抑制HGF诱导的肿瘤细胞的散射作用，同样条件下联合使用两种单克隆抗体却未见同样的效应。尽管双特异性抗体对胰腺癌细胞株的活力抑制作用较弱，将双特异性抗体与较低剂量的顺铂联合使用的效果优于单独使用顺铂，且这种方法可提高肿瘤治疗的疗效和安全性。并发现存在KRAS基因突变的细胞株对c-Met与EGFR双特异性抗体的敏感性欠佳，联合运用MEK抑制剂后，肿瘤细胞株的抑制效率增加4倍。

5.3 嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(chimeric anigen recepor T-cell immunoherapy, CAR-T) CAR-T细胞治疗是通过从患者血液中分离出T细胞，通过慢病毒或反转录病毒载体对其进行基因改造，使T细胞能够表达CAR(嵌合抗原受体)，从而能够特异性地识别肿瘤相关抗原，使其靶向性、杀伤活性较其他免疫细胞大幅提高[24]。CAR一般由胞外相关肿瘤结合区，胞外铰链区，跨膜区和胞内信号传导区构成。第1代CAR仅含有免疫共刺激信号分子CD3ζ，而目前的CAR引入的双共刺激分子可显著增强其抗肿瘤活动和嵌合抗原受体的持久性[25]。c-Met在肝癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌等肿瘤组织中异常高表达，在正常组织中低表达或不表达，为抗c-Met的CAR-T细胞治疗提供理论基础[4]。目前，在美国的临床试验官网(clnicalrails.gov)上已有抗 c-Met的CAR-T细胞治疗三阴性乳腺癌的临床试验注册。Kobold等[26]设计以CEA为靶向的CAR-T细胞，并在CAR-T细胞中传导EGFR基因，使其表达膜蛋白EGFR，联合使用抗EGFR和抗c-Met双特异性抗体增强肿瘤组织的T淋巴细胞募集，证实CAR-T细胞和双特异性抗体的联合治疗在T细胞的募集提高后，肿瘤细胞杀伤的作用明显增强。

综上所述，靶向c-Met信号通路的抗肿瘤治疗在实际应用中取得一定效果，但局限性日益明显，肿瘤微环境中的生长因子和特定的免疫细胞易导致靶向药物的耐药性，肿瘤生物学特征不断得到新的认识，这些均有助于今后抗肿瘤治疗的进一步发展。抗体偶联药物、双特异性抗体及CAR-T细胞治疗等治疗新手段逐渐运用于基础及临床试验，这些新的治疗手段同样面临安全性、有效性、经济性等问题，需要不断地积累经验，充分合理利用不同靶向药物的长处，从而使广大患者获益。

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(责任编辑：王全楚)

Advances in hepatocyte growth factor receptor signaling targeted therapy for gastrointestinal carcinoma

MIAO Xin，LIU Zheng

Medical Center for Digestive Diseases, the Second Clinical Medical College of Nanjing Medical University & the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210000, China

Hepatocyte growth factor receptor (c-Met) signaling plays an important role in promoting tumor cell proliferation, metastasis, invasion and tumor angiogenesis. Aberrant activation of c-Met signaling is shown to be associated with a number of gastrointestinal carcinomas. c-Met targeted therapy has become a hot spot in anti-tumor therapy, but many tumors develop resistance to the drugs. The molecular mechanisms of resistance include c-Met itself or downstream signaling protein gene mutation， bypass compensation mechanism of other membrane receptor signaling and non-specific inhibition of neutrophils c-Met signaling. With the improvement of biotechnology, antibody-drug conjugates, bispecific antibody and CAR-T cell therapy gradually become new methods for targeted therapy. This paper reviewed the c-Met signaling pathway, c-Met inhibitors, resistance of c-Met inhibitors and new methods of targeted therapy.

Gastrointestinal carcinoma; c-Met; Targeted therapy; Drug resistance; Antibody-drug conjugates; Bispecific antibody; CAR-T cell therapy

卫生部科学研究基金(kj2005-2-027);江苏省自然科学基金(BK2008483);南京市科技发展基金(KK14177)

缪鑫，在读研究生，研究方向：消化道肿瘤的基础研究。E-mail：1203101965@qq.com

刘政，主任医师，博士，博士生导师，研究方向：消化系统疾病。E-mail：liuzheng117@yeah.net

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.04.002

R735

A

1006-5709(2017)04-0365-04

2016-07-14