太子参均一多糖的分离与表征

杨 斌 庞文生 胡 娟.2*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122； 2.福建省中医药研究院，福建 福州 350003

药物研究

太子参均一多糖的分离与表征

杨 斌1庞文生1胡 娟1.2*

1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122； 2.福建省中医药研究院，福建 福州 350003

目的：对太子参抗二型糖尿病多糖活性部位(PF40)，进行分离纯化得到均一多糖并对其进行结构表征。方法：太子参粉碎后，通过水提醇沉法(40%乙醇)得到太子参粗多糖，采用DEAE-纤维素、葡聚糖凝胶柱对其分离纯化，得到一种均一多糖，采用高效凝胶渗透色谱法测定分子量，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)-柱前衍生高效液相色谱法分析单糖组成。结果：分离得到一种均一多糖，由葡萄糖组成，分子量为18400Da，命名为HPh-1-1。结论：太子参均一多糖HPh-1-1是一种葡聚糖。

太子参均一多糖；分子量；单糖组成

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm．的干燥块根，具有益气健脾、生津润肺作用[1]。多糖是太子参重要活性成分之一，研究表明，太子参多糖具有降低血糖、血脂[2～3]、改善胰岛素抵抗[4]等功效。课题组前期对太子参粗多糖以40%的乙醇沉淀，经药理实验验证，得到其抗二型糖尿病活性部位(PF40)[5]。本研究采用DEAE-纤维素、葡聚糖凝胶柱层析方法，对PF40进行分离纯化，得到均一多糖；并分析其分子量及单糖组成，为进一步探讨太子参多糖的化学组成及药理相关性研究奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Ultimate 3000高效液相色谱仪(Dionex公司)；UV-3200型紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；MOKULYOD-230型冷冻干燥仪(Thermo Fisher公司)；层析柱(上海锦华层析设备厂)；HL-2D定时数显恒流泵；DBS-100电脑全自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司)；AE240S型电子分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；BC-R501B旋转蒸发器(上海生物化工设备有限公司)；HH-4型恒温水浴锅(国华电器有限公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 材料 太子参(福建柘参种业有限公司)；Cellulose DE-52(Whatman公司，批号：1030A024)；Sephacryl S-300HR(GE公司，批号：10222040)；葡聚糖分子量标准套(中国食品药品鉴定研究院,批号，201203)；D-葡萄糖、D-甘露糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20140117)；L-鼠李糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-半乳糖、D-阿拉伯糖(分析纯，Sigma公司，批号：20120203)，乙腈(色谱纯，Merck公司，批号：608000203)，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、氯化钠、硝酸钠、无水乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚、浓盐酸、氢氧化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20140617)。

2 方法与结果

2.1 太子参均一多糖的提取与分离 干燥太子参粉碎后过40目筛，经90%乙醇回流提取3次；药渣经水提3次，每次2h，过滤，滤液经减压蒸馏浓缩至原体积1/20；Sevage法脱蛋白，溶液经90%乙醇沉淀，离心；沉淀用蒸馏水溶解，以终浓度40%的乙醇沉淀；离心，沉淀经无水乙醇、丙酮反复洗涤后冷冻干燥，得PF40多糖。经Cellulose DE-52柱和Sephacryl S-300HR柱进一步分离纯化，用苯酚-硫酸法跟踪检测，收集水洗脱馏分，经浓缩、透析后冷冻干燥，得到1种均一多糖组分，命名为HPh-1-1，分离流程见图1。

2.2 太子参均一多糖的相对分子质量

2.2.1 色谱条件 Ultrahydrogel 500、1000凝胶色谱柱串联(7.8×300mm)；流动相为0.1mol/LNaNO3溶液作，流速0.5mL/min，进样量20μL，柱温35℃。2.2.2 分子量标准曲线的建立 精密称取葡聚糖对照品，分子量分别为2700、5250、9750、13050、36800、64650、135350Da，用流动相配制成4mg/mL的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，供HPGPC分析用。将葡聚糖分子量的对数值(logM)对保留时间(tR)作图，得线性回归方程为logM=-0.1901tR+11.2723，相关系数r=0.9721。

2.2.3 样品分析 精密称取HPh-1-1，用流动相配制成浓度为4mg/mL的溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤，进行HPGPC分析。结果显示，样品色谱峰具有良好的对称性，纯度>97.92%；保留时间为36.82min，代入回归方程，计算得出HPh-1-1分子量为18400Da。见图2。

2.3 柱前衍生高效液相色谱法测定单糖组成

2.3.1 色谱条件 Hypersil BDS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为0.1mol/L磷酸缓冲盐(pH6.7)-乙腈(83:17，V/V)，流速1mL/min，检测波长254nm，进样量20μL，柱温30℃。

2.3.2 单糖对照品的衍生化 精密称取甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖对照品，各配制成2mg/mL溶液。分别吸取对照品溶液0.3mL，依次加入0.3mol/L的PMP甲醇溶液0.3mL，0.3mol/L的NaOH溶液0.3mL，混匀，于70℃水浴中反应100min，冷却至室温，加0.3mol/L的HCl溶液0.3mL中和，再加2mL三氯甲烷，充分混匀，离心，弃去下层液体。重复操作3次，上层水相经0.22μm微孔滤膜过滤，进行HPLC分析。结果显示，甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的保留时间分别为10.71、13.66、15.91、18.19、21.44、24.39、26.14min。

2.3.3 混合对照品的衍生化 精密称取甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖对照品各5mg置于10mL的容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容，吸取0.3mL，按“2.3.2”项下衍生化方法操作，上层水相经0.22μm微孔滤膜过滤，供HPLC分析用。

2.3.4 样品的衍生化 精密称取HPh-1-12mg，于具塞样品瓶中，加入2mol/L 三氟乙酸水溶液4mL，封瓶，于110℃水解4h。水解液经减压浓缩至干，加3mL甲醇后蒸干，重复操作4次；加1mL 蒸馏水溶解样品。吸取样品溶液0.3mL，按“2.3.2”项下衍生化方法操作，上层水相经0.22μm微孔滤膜过滤，供HPLC分析用。

2.3.5 样品的单糖组成分析 在所确定的柱前衍生高效液相色谱条件下，样品HPh-1-1仅出现1个色谱峰，与混合对照品谱图比较，为葡萄糖。HPh-1-1主要由葡萄糖单糖组成，其结构特征为葡聚糖。见图3。

3 讨论

近年来，太子参多糖的研究在化学成分、药理等各方面都不断深入。本研究采用DEAE-纤维素、葡聚糖凝胶柱联合应用对太子参多糖进一步分离提纯切实可行。分离出一种均一多糖HPh-1-1，通过高效渗透色谱法测得其分子量为18400Da，PMP-柱前衍生高效液相色谱分析表明HPh-1-1是一种葡聚糖。为太子参多糖化学结构和药理相关性进一步研究奠定了基础。

[1]王文凯，贾静，丁仁伟，等．太子参近年研究概况[J]．中国实验方剂学杂志，2011，17(12)：264-267．

[2] 姚先梅，段贤春，吴健，等．太子参多糖对实验性糖尿病大鼠血糖、血脂代谢和肾脏病理的影响[J]．安徽医药，2014(1)：23-26．

[3] 徐锦龙，徐爱仁，应景艳，等．太子参多糖对实验性糖尿病大鼠血糖及胰岛素的影响[J]．中华中医药学刊，2012(2)：423-424．

[4] 王琪，柴单单，吴晓华，等．太子参多糖减轻高脂诱导的小鼠肝脏胰岛素抵抗[J]．中国病理生理杂志，2015，31(4)：685-689．

[5] Juan Hu，Wensheng Pang，Jinlong Chen,et al．Hypoglycemic effect of polysaccharides with different molecular weight of Pseudostellaria heterophylla [J].BMC Complementary And Alternative Medicine，2013，13(1)：267．

Isolation and Characterization of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide

YANG Bin1PANG Wensheng1HU Juan1,2*

1．The college of Pharmacy, FuJian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122，China; 2．Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350003, China

ObjectiveTo further purified and characterized of Pseudostellaria heterophylla polysaccharide. Methods After crushing Radix Pseudostellariae, the polysaccharide was extracted by water and ethanol precipitation method(40% ethanol). The column of Cellulose DE-52 and Sephacryl S-300HR was used to separate and purify it. High performance gel permeation chromatography(HPGPC) was used to analyze the average molecular weight, high performance liquid chromatography(HPLC) of 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP) pre-column derivatization was used to analyze its monosaccharide components. ResultsA novel homogeneous polysaccharide, named as H-1-1, was obtained. The mean molecular weight of HPh-1-1was 18400Da and it was only composed of glucose. ConclusionThe Pseudostellaria heterophylla homogeneous polysaccharide HPh-1-1was a kind of dextran．

Pseudostellaria Heterophylla Polysaccharide；Molecular Weigh；Monosaccharide Components

国家自然科学基金资助项目(NO：81470175)。

杨斌(1990-)，男，汉族，硕士研究生在读，研究方向为天然药物化学。E-mail：1300808526@qq.com

胡娟，女，土家族，教授，研究方向为中药活性成分与质量标准。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R248.2

A

1007-8517(2017)04-0011-02

2016-12-02 编辑：梁志庆)