云南4个规模化猪场猪瘟抗体水平监测及免疫效果分析

刘永波，宋春莲，谢相悦，吴常月，王志方，凌万旭，颜宏奎，张庆伟，舒相华*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201；2.乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂，郑州，450000；3.昆明伟牧得生物科技有限公司，昆明，650201；4.山东省东营市黄河三角洲动物乐园管理有限责任公司，东营，257091）

云南4个规模化猪场猪瘟抗体水平监测及免疫效果分析

刘永波1，宋春莲1，谢相悦1，吴常月1，王志方2，凌万旭3，颜宏奎3，张庆伟4，舒相华1*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明650201；2.乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂，郑州，450000；3.昆明伟牧得生物科技有限公司，昆明，650201；4.山东省东营市黄河三角洲动物乐园管理有限责任公司，东营，257091）

为检测云南省某地区规模化养猪场猪瘟病毒抗体水平及免疫效果分析，通过监测整体猪瘟抗体水平来制定有效的免疫程序，并对抗体效价不合格的猪只及时补种疫苗，对猪瘟的防控有重大意义。本试验应用猪瘟正向间接血凝试验，检测了云南省某地区4个规模化猪场283份血清的猪瘟抗体水平。结果表明，猪瘟血清抗体水平≧1∶8的有74份，免疫合格率为73.9%。哺乳仔猪检测65份，猪瘟血清抗体水平≧1∶8的有22份，免疫合格率为66.2%。断奶仔猪检测74份，猪瘟血清抗体水平≧1∶8的有28份，免疫合格率为62.1%。育肥猪检测75份，猪瘟血清抗体水平≧1∶8的有21份，免疫合格率为72%。母猪检测69份，猪瘟血清抗体水平≧1∶8的有3份，免疫合格率为95.6%。所有猪群中断奶仔猪免疫合格率最低，与临床上断奶仔猪猪瘟发病率较高相吻合。

猪瘟;抗体监测;免疫

猪瘟，又称古典猪瘟，是由猪瘟病毒引起猪的一种急性、发热性、高度接触性传染病，以发病急、高热稽留和毛细血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等变化为特征，其流行广泛，发病率和死亡率高，对养猪业危害极大，因此备受世界各国关注，国际兽医局也将其列入一类法定传染病，并规定为国际重点检疫对象[1]。近年来随着养猪规模的扩大，饲养管理水平的参差不齐，猪瘟在各地的发病率呈逐年上升的趋势，临床表现以影响繁殖性能和隐形带毒为主[2]，并伴随其他继发感染病，给养猪生产造成巨大的损失。注射猪瘟疫苗以提高群体抗体水平是预防猪瘟发生的有效办法[3]。但目前在疫苗免疫接种上普遍存在一个很大的误区，即仅仅注重免疫密度，却忽视了免疫接种的质量[4]。免疫监测可为被检猪群是否需要继续免疫注射提供依据，是提高猪群群体免疫质量的关键。

本实验将猪瘟抗原吸附在红细胞上制成红细胞致敏抗原，加入倍比稀释的待检血清，如红细胞发生凝集，说明待检血清中有相应抗体与其结合，由此可推断待检猪体内有抗猪瘟病毒抗体，再根据发生凝集孔的稀释度数判断待检猪体内的抗体水平。

1 材料与方法

材料来源：血清：样品血清采自云南省某地区4个规模化猪场（四个养猪场编号为I、II、III、IV，四个猪场所采血样猪只均于三个月内免疫），共283头份，其中哺乳仔猪65头份，断奶仔猪74头份，育肥猪75头份，母猪69头份。血液采集后3000转10min离心，取上清液备用。

1.1 试剂及仪器

试剂：猪瘟间接血凝抗原，猪瘟标准阳性血清和阴性血清，稀释液，购自兰州兽医研究所。待检血清。

仪器：96孔V型血凝板，购自兰州兽医研究所。一次性透明医用手套，25、50微升微量移液器（17965，5～40μL：X15105，15～40μL：X18493，40～200μL：8排管E89364，5～50μL，芬兰)，微量移液器枪头，振荡器，水浴锅，恒温箱，湿盒，无菌青霉素小瓶（用于分装稀释液和抗原液）。

1.2 方法与步骤

1.2.1 加稀释液

96孔V型血凝板1-6排：用于检测待检血清，每排检测一个样品。每排1-10孔每孔加50微升稀释液。

96孔V型血凝板第7排：1-3孔为阴性血清对照，5、6孔为稀释液对照。1-3孔及5、6孔每孔加50微升稀释液。

96孔V型血凝板第8排：阳性血清对照。1-12孔每孔加50微升稀释液。

1.2.2 稀释待检血清

1号待检血清：取50微升加入第1排第1孔，混合稀释取50微升移致下一孔作倍比稀释，致第10孔弃50微升。

2号待检血清：取50微升加入第2排第1孔，同上。

1-10孔待检血清稀释梯度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1：1024

1.2.3 阴性对照血清的稀释

取阴性血清50微升加入第7排第1孔，倍比稀释，致第3孔弃50微升。阴性血清稀释度：1∶2，1∶4，1∶8。5、6孔为稀释液对照（只有稀释液）。

1.2.4 阳性血清的稀释

取阳性血清50微升加入第8排第1孔，倍比稀释，致第12孔弃50微升。阳血清稀释度：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，......1∶4096。

1.2.5 加血凝抗原

被检血清各孔、阴性血清各孔、阳性血清各孔、稀释液对照孔均各加25猪间接血凝抗原（充分摇匀，瓶底应无血球沉淀）。

1.2.6 振荡混匀

将血凝板置于微量振荡器上,振荡1-2min。

1.2.7 反应

盖上玻板，室温下或37℃下静置1.5-2小时判定结果，或延至翌日判定。

1.3 结果判定

以呈现“++”血凝反应的血清最高稀释度作为该血清的间接血凝抗体效价。血凝反应强度表示如下：

“++++”红细胞全部凝集，形成一层均匀膜，布满整个孔底。

“+++”红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者略小。

“++”红细胞在孔底形成薄膜凝集，边缘松散或呈锯齿状。

“+”红细胞沉于孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点。

“±”红细胞沉于孔底，但周围不光滑或中心有空斑。

“-”红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。

当阳性血清抗体效价≥1：256、阴性血清≤1：8、稀释液对照孔无自凝现象时，实验成立。接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体效价≤1：16为免疫合格。

2 结果

2.1 各猪场猪瘟病毒抗体检测结果I、II、III、IV四个猪场哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和母猪猪瘟血清抗体水平测定结果见表1。

2.2 不同年龄段猪群猪瘟病毒抗体检测结果哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和母猪猪瘟血清抗体水平比较

表14 个规模化养猪场猪瘟血清抗体检测结果

图1 不同年龄段猪群猪瘟病毒抗体检测结果

2.3 猪瘟血清抗体效价水平分布共检测猪瘟抗体283份，免疫总合格率为73.9%，其中血清抗体水平≥1∶8的有74头份。结果见表2。

表2 检测猪血清猪瘟抗体效价分布

3 讨论

3.1 随着养猪规模的扩大及猪群的转移，不少猪场因猪瘟的发生造成了重大的经济损失。发病猪群猪瘟血清抗体水平低下，不能保护猪群免受猪瘟强毒感染是关键所在。一般认为，猪瘟抗体效价≦1∶8才能够抵抗强毒感染[5]。本次调查结果显示：在283份血清中，效价≧1∶8的有74份，免疫合格率为73.9%。高于何启盖等[6]的调查结果，总免疫合格率只有55.84%，但猪群免疫不合格的比例达26.1%，存在感染强毒的可能。

3.2 I猪场、II猪场、III猪场和IV猪场分别检测72、75、66、70头份，猪瘟病毒抗体效价总合格率分别为66.7%、64%、90.9%和75.7%。检测结果显示III猪场猪瘟免疫保护率最高，II猪场猪瘟免疫保护率最低。

3.3 不同年龄段的猪群猪瘟血清抗体水平差异较大。哺乳仔猪、断奶仔猪、育肥猪和母猪血清抗体水平免疫合格率分别为66.2%、62.1%、72%和95.6%。4个猪场均为母猪的免疫效果比较好，断奶仔猪最低，建议在断奶前对哺乳仔猪进行猪瘟首免。

3.4 猪场普遍存在免疫率不高，其原因可能有以下几种：(1)免疫机能差，注射疫苗后产生抗体的效果不理想；(2)注射疫苗时注射分量不够，存在打“飞针”现象[7]；(3)疫苗质量问题；(4)猪瘟持续感染种猪，易引起免疫耐受，导致免疫失败[8]；(5)猪免疫抑制病的普遍存在也是造成猪瘟抗体水平低下的一个很重要的原因，如猪繁殖与呼吸道疾病综合征。另外，已经证实断奶仔猪多系统衰竭综合征病毒损害淋巴组织，引起广泛的淋巴细胞减失，导致并发或继发感染，可引起免疫抑制[9]。

3.5 建议这四个规模化猪场进行猪瘟免疫时应加强以下几个方面的工作：(1)检测是否存在免疫抑制性疾病，如猪繁殖与呼吸道疾病综合症、猪圆环2型等疾病，淘汰存在免疫抑制性疾病的猪；(2)免疫功能低下的猪隔离观察，特别是多次免疫仍达不到免疫要求的种母猪，可借鉴汤薇等[10]对低抗体水平母猪的淘汰方法；(3)注射疫苗时注射部位要准确，注射用针头型号应视猪而定，大猪用粗长针头，小猪用短细针头，要确保将疫苗注射在肌肉层内，防止疫苗渗漏；(4)购买质量好的猪瘟疫苗；(5)将疫苗接种与免疫监测有机结合，以免疫监测结果为依据制定合理的免疫程序[11]，达到最佳免疫效果。

[1]Romelt,M.(Roemelt,Maria),Klingelhofer,I(Klingelhoefer Irene).Classical Swine Fever in wild boar in Rhineland-Palatinate∶evaluation ofthe official control measures from2005-2011.［J］.2015：507-516.

[2]陈志明.规模化猪场猪瘟流行现状与防控思路［J］. 2014,(6)∶66-68.

[3]宁宜宝，吴文福等.我国猪瘟流行新特点与疫苗免疫研究［J］2011，45(8)∶33-37.

[4]孙华伟,赵永前,茅爱华,蒋晨慧,张敬峰等.某规模猪场猪瘟抗体水平的跟踪监测与应用.［J］2014(6)∶91-92.

[5]陈焕春,吴斌,何启盖,等.规模化猪场疫病控制与净化[M].北京∶中国农业出版社，2000.137-143

[6]何启盖,陈焕春,吴斌,等.规模化猪场猪瘟、细小病毒、口蹄疫抗体水平监测效果分析[J].中国预防兽医学报，2000，22(1)∶5-9.

[7]陈浩波，郑如胶.免疫失败的原因分析及相应对策［J］．广西农学报，2009，24（1）：50-52．

[8]王琴，宁宜宝.猪瘟免疫失败主要原因的解析［J］．中国兽医杂志，2005，41（6）：61-63．

[9]蔡宝祥.圆环病毒∶对畜禽免疫抑制的威胁.中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届全国会员代表大会及第9次学术研讨会论文集[C].烟台，2001.14-18.

[10]汤薇，王永明，高林.集约化养猪场对隐性感染猪瘟的检测与防制［J］．养猪，2000（2）：35-36．

[11]杨艳芹，樊福好.猪健康性能监测与检测数据的分析利用［J］．今日养猪，2006（6）：12-14．

S815.4

B

1003-8655（2017）01-0084-03

刘永波（1989-），河南人，男，在读硕士研究生，研究方向为动物疫病防控及中药免疫学，757259269@qq.com.

舒相华（1973-），云南腾冲人，男，副教授，博士，研究方向为动物疫病防控及饲料毒物学，1633992175@qq.com.